病毒滴度检测——腺相关病毒

使用 DNase I 及蛋白酶 K 消化 AAV 病毒样品。

腺相关病毒滴度检测采用实时荧光定量 PCR 法：

滴度单位：vg/mL，指每毫升中含有的病毒基因组拷贝数

1、检测步骤

1. 稀释标准品质粒，设置标准品的拷贝梯度为 10⁵ 、10⁶ 、10⁷ 、10⁸ 、10⁹ 、10¹⁰。
2. 配置 QPCR 反应体系，每个样品和标准品设计 3 个复孔，进行 QPCR 反应。

2、 数据分析（以 HBAAV2/9 -GFP 滴度测度为例）

1. 原始实验数据。Roche LC96 实时荧光定量 PCR 仪所测 Ct 值数据如下：
2. 标准曲线制作。以每组 AAV 标准品的Ct均值为纵坐标 Y，其对应的拷贝数的对数为横坐标 X，做标准曲线，得出标准曲线的函数公式及R平方值。
3. 待测样品滴度计算。将待测 AAV 样品 Ct 均值，代入第2点所得公式，计算所加入 AAV 模板拷贝数 X，再换算成滴度。换算公式为：AAV 病毒滴度= 10^x×400000（稀释倍数）vg/mL

对照病毒 HBAAV2/9-GFP 滴度 =1.6×10^12 vg/mL

Q：不同滴度测定方法有什么有优缺点？

A: pfu 比较经典，但重复性不好，且检测时间周期长；efu 简单耗时短，但需要穿梭质粒带荧光；TCID50 可准确测定具有感染力的病毒滴度，检测周期适中；VI 只能用于纯化后的病毒，检测颗粒数而不是活性病毒滴度。

Q：标准品的标准曲线公式中 R² 有什么作用？

A：R² 代表相关系数，一般机器默认的是 R2>0.99，这样才具有可行度和线性关系

Q：保存过久的病毒需要重新检测滴度吗？

A: 若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃ 保存，应尽快使用；如需长期保存则应放置于 -80℃，如超过六个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。

Q：腺相关病毒为什么不常使用 PFU、TCID50 等方式检测滴度？

A: AAV 感染不会导致细胞病变效应，因此，空斑实验不能用于确定其感染滴度，而 TCID50 法一般需要利用腺病毒作为辅助病毒，另一方面，常用的活性颗粒检测方法需要在细胞中检测，AAV 基因的表达需要较长时间，检测效率低。基因组滴度以 AAV 衣壳中所含基因组含量作为定量依据，测定的是含目标基因组的 AAV 浓度，方法简单高效。