腺相关病毒的包装

cvn：请大家分析下我的问题：本人用六孔板共转染（pAAV-IRES-hrGFP、pRC、phelper）包装空载体腺相关病毒，转染后48小时在荧光显微镜下看，一个视野内约有80%的绿色荧光。转染后第三天，收病毒。再将病毒原液感染种在六孔板内293细胞，48小时后在荧光显微镜下未见绿色荧光蛋白。

上述的过程，本人重复了三次。均未见绿色荧光蛋白。现在本人感到疲惫。请大伙帮忙分析分析。谢谢！

本人用脂质体2000转染，方法是：①转染前２４小时种板，②转染前一小时换液（用无血清的DMEM或有血清的DMEM；两种方法都用过），③转染：将三种质粒各1.33μg加入250μl无血清的DMEM；再将脂质体2000加入另一250μl无血清的DMEM内，静置５分钟；混合两者，静置２０分钟。然后以点滴的方式加在六孔板内。加毕，轻轻摇晃六孔板④六小时后，再次换液（含DMEM+10%FBS）。

收病毒的步骤：①转染后７２小时，用孔内的培养液将细胞吹下来，收于EP管内（２支）②将２支EP管先放入－７０度冰箱内约20分钟，再取出，放入37度水浴锅内约１０分钟。③反复冻融４次；④10，000g离心１５分，取上清液。

病毒原液感染的步骤：①将六孔板内的培养液吸出，加入上述的病毒液1.5ml。②感染后第二天，将液体吸出，换成DMEM+10%FBS；有一次感染时没有吸出原液。③感染后第二，三天，荧光显微镜下未见绿色荧光。

请大家帮忙分析一下，我的问题出在哪里。

丁香园网友乱爬的蚂蚁mm认为：

pAAV-IRES-hrGFP、pRC、phelper应该等摩尔比例转染。

丁香园网友cvn：

感谢回复，按照说明书：１０cm培养皿分别需要三种质粒各10μg，有此推断应当是等质量的。另外文献也是等体积做转染的。

急，急，从春节到现在都是白干。郁闷！！

大家讨看我的问题在哪里。郁闷！！

丁香园网友jachychen2005认为：

我们用的也是三质粒共转染体系，三者在直径10CM的培养皿中加的量是含目的基因的质粒10UG，RC10UG，HELPER15UG.

丁香园网友holywar认为：

从你的操作看没有问题，我们做的很粗糙都可以的。

如果你的质粒肯定没问题的话应该考虑细胞的问题，以前我包腺病毒的时候用过四株293A有两株好用，然后再包AAV只有一株能出毒，为了细胞得事花了好长时间，感觉AAV对细胞的要求挺高，得先确认你得293起码能出AV，或者你找个已经证明好用得AAV系统再转你得细胞试试看看.

丁香园网友cvn：

你们用脂质体转染还是用磷酸钙。为什么helper要加１５ｕｇ，要按摩尔比吗

丁香园网友jachychen2005认为：

是应该等摩尔比的

丁香园网友jachychen2005认为：

STRATAGENE 公司的网站上有三质粒包装系统的详细的步骤及注意事项

丁香园网友田鼠117：

cvn，你好，请问一下你的那个问题解决了吗?我目前也在包装AAV，和你情况差不多，每次在荧光下细胞看起来都是很多，但是纯化后再次转染293细胞后，却一点都看不到，很郁闷.请问你有什么好的想法吗?谢谢

丁香园网友小白菜－12－zy：

我想问一下，你只看了荧光，有没有看到病变或空斑？

我觉得你这种情况问题不是出在转染上，你有80%的荧光说明载体是转染进入了细胞。但是第二轮无荧光说明载体转入但没有包装成病毒

所以我认为有两种可能性：

第一：你的载体腺病毒表达系统是否有问题

第二：你的293细胞是否有问题，换一株293试一下

个人觉的载体表达系统有问题可能性大一些

丁香园网友田鼠117：

小白菜－12－zy，谢谢你，我也是觉得载体表达系统可能有问题，并不像其他人所认为有绿色荧光表达就表明有病毒的合成．而至于细胞的问题应该不大，是这样的吧？

丁香园网友kangdejiao认为：

如果载体腺病毒表达系统是否有问题

你细胞的活性对包装病毒影响也是很大的，比如代数，293也有不同的类型，你的这株确定是用来包装腺病毒的吗/

在你转染后，观察荧光，只能说明你已经将载体转入细胞了，要看是否有病毒出来，你还得观察CPE，

我将你的步骤仔细看了下，你的出病毒的时间是否太短了，说不定就快要出病毒了，你就把细胞收，收细胞时间太早了。

还有你出毒是是否少了一个步骤。

也许你的毒是有的，再次感染，是没有一点荧光吗/说不定是滴度太低，还没有在细胞表达了，感染时为什么要将培养液吸出呢/

包装是个漫长的过程，上面的就是我个人的观点，

丁香园网友田鼠117：

小白菜－12－zy，可以问一下你是用的什么方法纯化病毒的呢？