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🔥 腺病毒包装

相关实验:腺病毒包装

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合作专家 | 张荣钊博士

病原生物学 福建医科大学

材料与仪器

腺病毒载体、目的基因、宿主细胞

转染试剂、超滤管、超高速离心机、水浴锅

步骤

1、细胞转染(以转染 6 孔板为例)

① 250 μl DMEM 和9 μl PEI 配成 Mix 1,静置 5 min 以上。

② 250 μl DMEM 和 1 μg 穿梭质粒、2 μg 包装质粒(即腺病毒骨架质粒),配成 Mix 2。

③ 将 Mix 1 和 Mix 2 混合,涡旋振荡混匀,瞬离后,静置 15 min 以上,以便有充足的时间形成 DNA-PEI 复合物。

④ 将静置后的混合液逐滴加入至 6 孔板细胞中。

2、扩增病毒

①传代后的第 7~10 天,将六孔板中有 CPE 的细胞连同培养基吹下移至 15 mL 离心管中,30 min 后,将管子放置于 37 °C 水浴锅中,解冻 15 min,如此反复冻融两次以裂解细胞。

②冻融完成后,3500 rpm,4 ℃,离心 15 min,去除细胞碎片,将病毒粗提液保存于 -80 °C 冰箱。

3、腺病毒液浓缩

① 将上一步骤的病毒上清用 0.45 μm 的醋酸纤维素膜过滤。

② 将过滤后的液体置于一个 15 mL 的超滤管中,50000 g,4 ℃,离心 2 h。离心完毕后,将离心管拿回安全柜中,小心倾倒上清,将离心管倒扣在吸水纸上沥干残液。

③ 取 1 ml 预冷的 DMEM,依次加入到离心管中,用剪去尖头的枪头,重复多次地半量吹打沉淀,轻柔操作,将离心管底部的沉淀完全重悬于 DMEM 溶液中,再用 1 ml DMEM润洗一遍,共得 2 ml 病毒浓缩液。每管 100 μl 小量分装于病毒专用管中,置 -80 °C 保存。

注意事项

1、病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统(尽量使用成熟的商业化载体系统)、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制(24、48 小时的细胞及荧光状态判断)、目的基因对病毒包装影响(基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功)。

2、如果有细胞培养和细胞转染实验的常规经验,细胞因素应该没有什么问题(细胞培养人员一定要关注,包装或转染感染前一定要重视细胞干净细微污染与否、饱满立体感是否好、铺板均匀细胞密度适中否),细胞产毒出毒期间过程中的活力是包装正常和出来的病毒滴度高低的一个重要环节。

来源:丁香实验

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