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    基本方案 瞬时转染 293 细胞制备无腺病毒重组腺相关病毒载体

    相关实验：重组腺相关病毒载体的生产实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    293组织培养细胞系 pSub201质粒 pXX2质粒 pXX6质粒
    完全DMEM 10%FBS培养基 完全IMDM 10%FBS培养基 CaCl2 纯DMEM 2%FBS 培养基 干冰 乙醇浴 硫酸铵 饱和硫酸铵 乙醇 PBS
    组织培养板 —次性聚苯乙烯及聚苯乙烯离心管 细胞刮 聚苯乙烯离心瓶 离心机 超声破碎仪 探针 高速聚丙烯离心管 穿孔透析盒

    步骤

    1•用限制性内切核酸酶X k I 和 讯 ndHI消化pSub201质 粒 （ 图 12. 3. 2)，切下rep 和c o p 片段，纯化长4000bp含 A A V I T R 的骨架。在 位 点 插 入 目 的 外 源 基 因 构建r A W 质粒载体。通过双CsCl梯度分离法将irAVV载体、 pXX2 和 pXX6 质粒 大量纯化（ 至少Img)。 2•在15c m 的皿中种2107细胞以期在第二天早上达到7 0 % 〜8 0 % 融合率。保持293个 细胞线在含10% F B S 的 D M E M 完全培养基中，将皿中接近融合的细胞通过0. 05% 胰酶的E D T A 消 化 （ 见附录3 1 ) 后分装到4 或 5 个 15c m 皿中扩大培养（ 本实验共 需 20个皿） 。 3 . 扩大培养12〜16h ，将每个1 5 c m 皿中培养基弃除，加入25ml含 1 0 % F B S 的I M D M 完全培养基。孵育3h 后开始转染细胞。 4•为了转染4 个 15c m 皿，将下列物品在一次性地于50m l 聚丙乙烯管中混合： 90咫 pXX 6 辅助质粒（ 腺病毒辅助基因） ； 30jug r A A V 细菌质粒； 30/xg pXX 2 辅助质粒（ A A V 辅助基因） ； 0. 4ml 2. 5mol/L C a Q 2 溶液；
    加去离子水至4ml。 总 D N A 量约为37. 5哗/板，且 A A V 辅助质粒、 A d 辅助质粒和rA A V 细菌质 粒的摩尔比约为I : 1 : 1。 5.加 4ml 2X HeBS溶液于第4 步所得混合物，用 IOmI 塑料移液管吹吸3 次混勻。室温 孵 育 1〜5min。在 40X 显微镜下可见明显沉淀（ 如果沉淀过粗，减少孵育时间） 。 6•将含D N A / CaCl2 沉淀的悬液摇5s 混匀，然后向4 个 15c m 平皿中的细胞分别逐滴 加入2m l 第 3 步所配培养基。摇平皿使溶液分散开。 7. 重复第4〜6 步每次转染4 个皿，直 至 20个皿转染完毕。孵育细胞24h。 8. 孵育24h 后，吸出培养基（ 为防止细胞脱水，一次操作两个平皿） ，然后加预热至 37°C 的含2 % F B S 的 D M E M 25ml。孵育细胞直至48h 后转染完毕。‘ 9. 用细胞刮从组织培养平皿中把细胞刮下，收获细胞和培养基从而收获细胞和上清液， 将悬液转至250m l 聚丙烯离心管中。 1〇•将悬液放入干冰/乙醇浴中和37°C 水浴箱中反复冻融（ 除去病毒质粒）3 次 （ 悬液 可在一20°C 下保存6 个月） 。 11. 4°C ， 3000g 离心IOmin沉淀细胞。倒上清至另一新的250m l 聚丙烯离心管。分开 保存上清液和细胞沉淀。 12. 为了沉淀上清液中的病毒，每 250m l 上清液中加入（ NH4)2SO4 78. 25g，充分混勻 硫酸铵，然后继续冰上沉淀20min。 4°C ， 8300^•离心lOmin。 13. 轻轻将上清液倒人另一容器，将其与离心管壁上和底部的浅黄色沉淀分离开。高压 灭菌处理上清液（ 勿用漂白剂）后弃之。将含有沉淀的离心管继续放在冰上沉淀， 直到第11步的沉淀处理好。 14•往第11步所制的沉淀中加人20ml OPTI-MEM I 培养基，用吸管上下吹打或旋勻 使沉淀溶解。转至一次性50m l 聚丙烯离心管。 15.戴上声保护装置，室温下在病毒组织培养盖中声处理细胞沉淀（40burstS， 5 0 % 的 功率，力度2 ) 。见沉淀变成混浊细胞溶液。 16•室温3000g 离心5min，用于沉淀不溶解的碎片。收集澄清上清液并转至一个一次 性的50m l 聚丙烯离心管中。 17•用20ml O P T I - M E M I 培养基重新溶解沉淀，重复第14〜16步。 18. 混合第16〜17步所得上清液。用吸管将这些混合后的上清液吹打离心管（ 第 13步 所得）壁及底部使得硫酸铵沉淀溶解。 19. 量得第18步所得液体体积，将饱和硫酸铵与p H 7. O 的含病毒的悬液按1 :3 的比例 混合。混勾后，置于冰上l〇 min。 20. 4°C ， 7700g 离心IOmin (可见管底有黄色沉淀） 。将每种上清液转至50m l 高速聚丙 燦离心管。 21. 根据第18步所得溶解产物体积，将 4°C 饱和硫酸铵溶液和溶解产物按2 : 3 的比例 混合，将此样本置于冰上20min。 22. 4°C ， 17 OOOg离心20min，此时有大量沉淀形成。将沉淀移出，弃上清前高压灭菌 (勿用漂白剂） 。 23. 用20ml (共20〜40个平皿）1 . 3 7 % 的 CsCl溶解沉淀，当沉淀尽可能完全溶解时，
    混合后，才看不见不溶物。 24.往 2 个 12. 5m l 的超净管中分别加入0. 5ml I .5g / m l 的 CsCl溶液。将管倾斜，再分 别缓慢加入约12m l 病毒标本覆盖I.5g / m l 的 CsCl溶液。随着标本的配制将管子沿 着边缘竖立起来。 25.15°0,288 00(^离心标本36~4811。以50(^/111丨11的速度减速，而后关闭刹车阀。在 管的中央可见一可能存在的弥散性的A W 环。 26•用7 0 % 的乙醇擦拭离心管的外部，在管底部呈90°角插入一 21G 针 Icm使得这—角 度可以导人无菌微管。每 管 10滴 ，收集15〜20份 。 27. 用一 r A W 特有探针通过打点从每份样本中取1〜5^1来测定找出高峰（ 见支持方 案 1)。 r A W 峰 值 在 1. 40〜I.42g/ml 梯 度 ，可 以 用 折 光 计 验 证 （ 用 后 需 将 折 光 计 擦 干净） 。 28. 可选做：加 1.37g/ml C sC l溶液至每份中使得终体积为12ml。加 〇.5m l浓度为 1.5g/m LCsQ溶液至一超净管中，将病毒溶液置于其上如第2 4 步，重新离心，导 入管子，测定梯度同第25〜27 步。 29. 4°C，用 MWC〇 10 000 Slide-A-Lyzer 透析盒加入 3 次 500ml 无菌 I X PBS 透析 rAVV，至 少 3h (或过夜)。 3〇.将病毒溶液等量分装（ 一 般 100〜200jul) 以避免反复冻融。菌液可在一2(T C 或 一80°C 保存至少一年。 备选方案用肝素纯化柱纯化 r A W 附加材料（ 基本方案；标V 的条目参见附录1) VPBS-MK n/ 1 5 % 、 2 5 % 、 4 0 % 和 6 0 % 碘克沙醇 P B S - M K 包含 lmol/L NaCl 0. 5mol/L NaCl 2 0 % (V /V ) 乙醇 酸 红 （Life Technologies) 乙醇 Econopump 螺 动 泵 （ Bio-Rad 公司） 32. 4m l 密封玻璃管（ Beckman公司） 50|ul桂酸硼毛细玻璃移液管（ Fisher公司） Beckman超级离心管和70T i 转 头 （ 或等效物） Iml 或 5ml HiTrap 肝 素 柱 （Amersham Biosciences 公司） F P L C 仪 Slide-A-Lyzer 穿孔透析盒 （M W C O 10 000) 工.开始转染，从 r A W 中去除硫酸铵沉淀（ 基本方案，第 1〜2 2 步） ，用 PBS-M K 溶 解硫酸铵沉淀，加 至 15m l刻度线。
    2. 启动Econopump，将一次性硅酸硼毛细玻璃管插人管中。按照说明书校对泵。将溶 有磷酸盐沉淀P B S - M K (第1 步所得）等量分装于两个密封玻璃管中。 3. 每个管中插入一毛细玻璃管，以 3ml/m i n 的速度抽吸，用 6ml 1 5 % 碘克沙醇和 lmol/L NaCl无气泡地将菌液覆盖。 4•用第3 步的技术，先后加入5m l 的 2 5 % 碘克沙醇和5ml 4 0 % 的碘克沙醇（ 迅速包含 病毒）覆盖菌液。 5. 加入5ml 6 0 % 的碘克沙醇覆盖后设置了梯度，小心移动毛细玻璃管而不打乱梯度。 缓慢往病毒溶液中加人P B S 形成管的最上层直到管被装满。 6 . 每管盖上塞子， 15°C〜25°C， 500 OOOg• 离 心 lh。 7. 小心移动管子，在病毒罩中，打开密封塞，插入一与5m i 注射器相匹配的18G 针头 至 6 0 % 碘克沙醇那部分之上，抽出4 0 % 碘克沙醇溶液（ 明显分层） ，留下的〇.5ml， 所以2 5 % 碘克沙醇溶液带不会被抽出来（ 图 12. 3. 3)。有需要的话4°C 保存病毒 过夜8 . 用缓冲液A (PBS-M K ) 泵洗，然后在F P L C 中插人一肝素柱。 来 自 2 0 个 15c m 平 m 的 一 种 病 毒 可 用 一 个 I m l 的 肝 素 柱 纯 化 ，更 大 量 则 需 — 5m l 肝 素 柱 。 9 . 用 5 倍柱体积的缓冲液A (PBS-M K ) 平衡柱。为了注射标本，将抽吸速度减为iml 柱 0_2ml/min或 5m l 柱 lml/min，然后注射标本。收集过柱的部分（ 洗漆，流过， 洗脱)。 10. 用 5 倍柱体积的缓冲液A (PB^ M K ) 洗柱。 11. 用 5 倍柱体积的缓冲液B (含lmol/L N a C l 的PBS-M K ) 按线性梯度从0% 〜]_〇〇 %
    洗 脱 联 合病毒，收集其中的〇.5ml (Iml柱）或 Iml ( 5 m l 柱) 。 比 用 两 倍 柱 体 积 的 缓 冲 液 B ( 含 lmol/L N a C l 的 F B & M K ) 洗 柱 。取 出 肝 素 柱 弃 之 。 13. F P L C 分 析 病 毒 前 用 〇.5mol/L 的 N a O H 顺 着 内 管 流 过 灭 菌 。用 2 0 % 的 乙 醇 装 满 内 管 保 存 。均 用 新 的 肝 素 柱 纯 化 病 毒 避 免 准 备 好 的 病 毒 之 间 的 交 叉 污 染 。， 为 了 找 出 病 毒 的 高 峰 值 （ 支 持 方 案 1 ) ，用一 A V V 专 用 针 通 过 打 点 的 方 法 测 定 整 个 病 毒 纯 化 物 的 各 部 分 。 15.将含有最高rAAV滴定量的部分倒出，用 MWCa 10 000 Slide-A-Lyzer透析盒将两 个 IL 变化的PBS 4° C透析2h。 工6.将病毒悬液分成1〇〇〜 200/x l的等份。 一 20°C或一80°C下 保 存 （ 可保存一年以上） 。 支持方案1 用打点分析法测定r A V V 的滴定量 在 这 一 部 分 有 一 明 显 标 志 表 明 r A W 病 毒 体 制 备 成 功 ，且 定 量 得 出 每 毫 升 有 一 定 量 的 病 毒 体 。 材 料 （ 标V 的条目参见附录1) 病 毒 部 分 或 终 病 毒 的 准 备 （ 基 本 方 案 或 备 选 方 案 ） V D N a s e 消化缓冲液 V 0. lmol/L E D T A V 蛋 白 水 解 酶 溶 液 0. 5mol/L N a O H 用 于 重 组 病 毒 的 r A A V 质 粒 （ 基 本 方 案 ，第 1 步 ） V T E buffer , pH7. 5 0 •5mol/L N a O H 包含 lmol/L NaCl V 0. 4mol/L Tris • Cl pH7. 5 0. 5mol/L NaCl 包含 0. 5mol/L Tris • C l ， pH7. 5 转 基 因 用 放 射 性 标 记 探 针 （ 根 据 生 产 商 的 说 明 书 ，用 Boehringer M a n n h e i m 随即引 物 D N A 标 记 试 剂 盒 进 行 操 作 ） 9 6 孔 板 50°C 水浴 箱 圆 点 印 记 仪 0. 45jum 尼 龙 膜 （ Zeta-Probe， Bio-Red) 1• 设 计 一 个 于 9 6 孔 板 成 对 地 对 样 品 、控 制 样 、标 准 D N A 定 位 的 实 验 方 案 。 2 . 将 样 品 （ 通常加5JLJCSC1，如果这种病毒有C s C l则取柱子纯化的20一混合物）和控 制样于9 6 孔板的适当位置，在每个孔中加D N a s e 消化液6〇 4 并 37°C孵 育 lh。 3 . 每 孔 加 IOfJ 〇. l m d / L 的 E D T A 停 止 消 化 ，混 匀 。加 60M1 蛋 白 酶 溶 液 使 病 毒 体 D N A 释 放 ， 50°C 孵 育 半 小 时 。 4 . 每 孔 加 120^10. 5mol/LNaOH 使 病 毒 DNA变 性 ，并 在 室 温 下 孵 育 l 〇 min。 5 . 准 备 线 性 化 的 质 粒 （ 用 于 这 种 病 毒 转 染 的 质 粒 ） O.ljug/Vl用 于 制 备 D N A 标 准 浓 缩 物 。用 IOOjLzl、 pH7. 5 的 T E 缓 冲 液 制 备 稀 释 5 倍 的 溶 液 ，通 过 加 12. 5|ul D N A 到
    112. 5^1 T E 缓 冲 液 （ 在 第 1 步）紧接着混合25“ 从一个孔到邻近的孔（ 分别为 625ng、 125ng、 50ng、 ln g 、 200pg、 40pg) 。 6 . 力口 IOOjLtl 0 •5mol/L N a O H /lmol/L NaCl 到每个孔来变性 D N A 标准物 D 7 . 用 p H 7.5 的0.4m d / L Tris . Cl平衡尼龙膜，准备提前润湿的尼龙膜的圆点印记复 合仪。 8. 加没有经过真空处理的变性D N A ，接着做真空处理。 9. 打开仪器，取出尼龙膜，于 100ml p H 7. 5 的 〇.5mol/L NaCl/0. 5mol/L Tris • Cl 中 轻轻振荡清洗5min。 10. 用放射物标记特异的r A A V 序列探针（ 如 A P P E N D I X 3G ) 检测冲洗的滤膜。 探针应该被限定在基因转化暗盒里并且不包括质粒的主链片段或I T R 序列。 11. 将滤膜对准胶片曝光（ 放射性自显影） 。显影结束后，对准部位，删除滤膜部分， 用闪烁计数器进行定量分析。计算多少标准质粒分子复合给定的r A A V 稀释液。 切记质粒是双链D N A ，而 r A A V 病毒只包含单链D N A 。 支持方案2 细胞体外感染r A A V 和用转基因表达进行效价研究 转导的效价随细胞类型的不同而有所差别，但对于标准的细胞株来说，转导效价可 通过相同转基因r A A V 的比较来得出。这种效价能通过确定特定细胞的特定转基因的效 率的颗粒的数目来比较。当永生细胞株被培养和在体内转导相比较时效价也会不同。 注意：为了评价转导效价，将细胞同时用腺病毒转导（ 见单元12.2)，这种方法起 到了协助病毒和提高转导效率的作用。添加腺病毒能够诱导更适合A A V 感染的环境， 这样能更好地指示有转导能力的颗粒的数量。但是，由于腺病毒有抗原性并且不能在体 内使用，所以它会有细胞病理效应。因此，用腺病毒在体外推导出的效价不能精确地反 映体内的转导能力。这需要每位研究者分别对不同的r A A V 试剂建立一套标准的滴定 程序。 材料 靶细胞 靶细胞培养基（ 见补充的细胞说明书） 有适当的转基因的r A A V (见基本方案或备选方案） 组织培养板（ 为分析转导的效价，推荐使用多壁板） 1. 在有合适的培养基的多壁组织培养板上种上适当的靶细胞。 合适的靶细胞类型，数目和密度有表达分析来决定。细胞在感染前不能用〇;^八 合成抑制剂（ 如阿糖胞苦）处理。 A A V 是一种单链病毒，并且基因能够表达时需要 合成双链。 2. 直接在细胞培养基中加rA A V 或在加入细胞前将r A A V 与新鲜培养基迅速混合。为 分析转导效价，将 r A A V 原液用血清稀释5 倍后感染细胞。 也可以在种板的时候感染细胞。孵育时间依分析方法而定。合适的r A A V 的数 量由转移基因、细胞和分析方法决定。当感染复数为5 时 （ 见 上 注解） ， 5 型腺病毒 可以随意的与r A A V —起加 入 。

    来源：丁香实验

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