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🔥 慢病毒感染悬浮细胞(浓缩感染)

相关实验:🔥 病毒包装与转染

最新修订时间:

丁香实验推荐阅读

合作专家 | 李子涵博士

肿瘤免疫 中山大学

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审核专家 | 孔旭博士

生物学 厦门大学

原理

慢病毒(Lentivirus)载体是以 HIV-1(人类免疫缺陷 I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,慢病毒具有更广的宿主范围,对于分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。

用途

重组蛋白,抗体生产,基因编辑,功能性研究和移植瘤构建。

材料与仪器

无菌 1 × PBS,293T 细胞,鼠源 CD8+T 细胞,opti-mem 培养基,转染试剂(Lipofectamine3000 等), 慢病毒质粒(psPAX2/pMD2.G/载体质粒),细胞培养箱,细胞计数器等。

步骤

(1)293T 细胞转染(病毒包装)

Day1:取对数生长期的 293T 细胞按照 10 × 106 的细胞数铺入 10 cm 的培养皿中,使该细胞于第二天融合度达到 90% 左右。

Day2:在 24 小时之内,观察 293T 细胞的汇合度在 90% 时,根据转染试剂说明书向其中加入 DNA-脂质体复合体,制备方法如下:

a)在 500 µl Opti-MEM 无血清培养基中加入转染试剂,混合均匀并置于室温 5 分钟。

b)在 500 µl Opti-MEM 无血清培养基中稀释 DNA,总质量为 15 µg 按照载体质粒 : psPAX2 : pMD2.G = 4 : 3 : 1 的比例加入 DNA。

c)将稀释后的 a)和 b)轻轻混匀,常温静置 20 分钟,形成 DNA-脂质体复合体。

Day3:将复合体轻柔的滴加至细胞培养皿中,轻轻摇晃培养皿混匀,放入细胞培养箱中培养。

Day4:收集培养第 48 h 的 293T 细胞病毒上清液,将收集到的病毒上清放置于 4 ℃ 冰箱中。并更换新鲜培养基培养 293T。

Day5:收集培养第 72 h 的 293T 细胞病毒上清液,合并 48 h 的病毒上清液。

(2)浓缩病毒

将合并的病毒上清液取出,待用。将离心机温度降温到 4 ℃,600 g,离心 15 分钟,取上清液经过 0.45 µm 滤头过滤转移至新的离心管中。配置病毒浓缩液,病毒浓缩液的配置方法如下:

试剂

体积

PEG6000

9.4 ml

PBS

4.29 ml

4M NaCl

3.91 ml

病毒液

20 ml

将浓缩后的病毒放置于 4 ℃ 冰箱摇床,旋转过夜。

(3)感染 CD8+T 细胞

a)离心浓缩后的病毒:浓缩后的病毒过夜放置,在离心机 4℃ 条件下,10 000 g,离心 2 小时。

b)激活 CD8+T 细胞:通过细胞计数,按 0.3 × 106/孔的细胞数铺入 96 孔板,每孔加入 300 µl 的 T 细胞培养基 (加入 CD3e/CD28,用于刺激细胞),激活至第三天感染。

c)在 CD8+T 细胞刺激的第三天将病毒加入细胞中:将离心后的病毒的上清完全去除,用 T 细胞培养基重悬病毒(一个 10 cm 大皿可以感染两个孔,每孔 200 µl),在其中加入 PolyBrene,终浓度为 7.5 µg/ml。去除 CD8+T 细胞中的大部分培养基,向其中加入重悬好的病毒,并轻柔混匀每孔细胞。

d)封板,2 000 rpm,37 ℃ 离心 90 分钟,放入培养箱静置 4 小时。将离心后的细胞放入细胞培养箱中进行培养,2~4 小时后吸弃病毒上清,补加新鲜的 T 细胞培养基。

(4)检测 CD8+T 细胞感染效率

将感染后第二天的 T 细胞从 96 孔板转移到 48 孔板中,根据细胞的密度分孔培养,补加新鲜培养基。取感染后 3 天的 CD8+T 细胞若干,根据质粒的标签,进行流式染色或者 Western blot 效率验证。

注意事项

1、293T 细胞不能铺得太稀或者太满,确保 24 h 内进行转染,否则产病毒颗粒效率低,导致感染效率低。

2、293T 包病毒的第 48 h 观察培养基颜色是否为橙红色,若出现黄色或者金黄,说明 293T 状态不行,或者铺板时候细胞太多了。出现该情况不建议再进行感染,放弃本次实验。

3、收集 72 h 病毒后,可取部分 293T 细胞进行转染效率验证。

常见问题

1、293T 细胞铺得过稀或过多,根据实验室摸索,按 10-12 × 106 的细胞数铺入 10 cm 大皿,第二天能达到 90%。

2、感染完后细胞状态不好应及时换液

3、感染效率极低,可能考虑细胞不易转染,或者是细胞状态不好。

来源:丁香实验

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