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🔥 病毒包装与转染

实验分类:

微生物实验

最新修订时间:

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合作专家 | 李子涵博士

肿瘤免疫 中山大学

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审核专家 | 孔旭博士

生物学 厦门大学

简介

质粒 DNA 和其他包装质粒共转染至细胞(293T 细胞)产生病毒,称为病毒包装。

原理

以慢病毒包装为例,主要包括 3 个质粒:质粒 DNA 可以转录出慢病毒遗传物质(RNA),但不能翻译出慢病毒的外壳及蛋白成分的载体质粒,其同时含有目的基因和报告基因,psPAX2 是可以表达慢病毒外壳的质粒,其表达产物可通过粘附机制更易穿过细胞膜。

pMD2.G 为慢病毒的膜蛋白质粒,通过脂质体进行三质粒共转到靶细胞基因组中,宿主基因组在表达时,随宿主基因转录出的目的基因 RNA 与 psPAX2、pMD2.G 基因翻译出的蛋白组装为慢病毒。病毒进入细胞后,其遗传物质 RNA 逆转录出 DNA,该基因再整合到靶细胞的基因组中,完成转染过程。

因为质粒 DNA 只能转录出病毒 RNA 和表达目的基因却不能表达出病毒的外壳和膜蛋白成分,因此其不能像普通的病毒一样在宿主细胞能反复增殖,故对宿主细胞是无害的并且高效的将目的基因转染到靶细胞基因组中。

来源:

操作方法

🔥 病毒感染细胞前准备(293T 包装病毒)

质粒DNA 和其他包装质粒共转染至细胞(293T 细胞)产生病毒,称为病毒包装。

🔥 慢病毒感染悬浮细胞(浓缩感染)

(1)293T 细胞转染(病毒包装)Day1:取对数生长期的 293T 细胞按照 10 × 106 的细胞数铺入 10 cm 的培养皿中,使该细胞于第二天融合度达到 90% 左右。Day2:在 24 小时之内,观察 293T 细胞的汇合度在 90% 时,根据转染试剂说明书向其中加入 DNA-脂质体复合体,制备方法如下:a)在 500 µl Opti-MEM 无血清培养基中加入转染试剂,混合均匀并置

🔥 逆转录病毒感染悬浮细胞(上清感染)

(1)293T 细胞转染(产病毒,病毒包装)Day1:取对数生长期的 293T 细胞按照 10 × 106 的细胞数铺入 10 cm 的培养皿中,该细胞于第二天能长至 90% 即可进行转染。Day2:根据转染试剂说明书,分别用 opti-mem 培养基孵育质粒和转染试剂若干分钟后,轻柔混匀,逐滴加入至 293T 细胞中。Day4:收集培养第 48 h 的 293T 细胞病毒上清液,用于感染 T 细

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