病毒滴度检测——慢病毒

细胞准备

将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至 1x10⁵/mL, 加入 96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备 6 个孔。放入 37°C ，5 % CO₂  培养箱中培养。

慢病毒滴度检测采用稀释计数测定法

滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

1. 加病毒

第二天，准备6个1.5 mL EP管，第一个EP管中加入10 μL病毒原液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度。

2. 追加培养液

第三天，有需要加puromycin筛选的孔，先吸去100 μL含病毒培养基，加入100 μL 含1.5 μg/mL puromycin的10 % FBS完全培养基。  

3. 观察结果并计算滴度

第五天，在荧光显微镜下观察结果，在观察结果前6 h需更换新鲜10 % FBS完全培养基，从孔中吸出80 μL培养基，然后加入80 μL新鲜10 % FBS完全培养基，放入37°C ，5 % CO₂  培养箱中培养。6 h后荧光显微镜下观察结果，荧光或活细胞百分比在10~50 % 的孔计算病毒滴度。

滴度（TU/mL）= 细胞数×阳性克隆百分比×MOI（1）×病毒稀释倍数×10³ TU/mL

Q: protocol 中使用抗生素筛选法计算滴度需要注意什么？

A：抗生素浓度需要预先做实验摸好浓度，选择最低的能够 100% 杀光所有细胞的浓度。对于常见的 Puromycin 来说，测量的时间点是加药 2-3 天后，Hygromycin 是加药 4-5 天后。

 

Q：稀释计数测定法与 PCR 法测定病毒核酸量，ELISA 法测定病毒外壳蛋白量最大的区别在于？

A:后两种方法没有考虑慢病毒的活性，死病毒会一并被测出来。

 

Q：抗生素筛选法和荧光报告基因法有很大的区别吗？

A：从原理上来说，两种方法并没有本质上的区别：它们都是计算阳性细胞的比例，从而换算原始的病毒活性滴度。但是，若细胞培养的时间较长，阳性细胞比例的变异度就会增大。

荧光报告基因法的实验流程较短，在感染 48~72 小时后，待荧光基因充分表达，即可测定。 然而，抗生素法则需要等抗性基因充分表达后，再加入抗生素筛选数天，待彻底杀灭阴性细胞后，才能进行细胞计数并换算滴度。