慢病毒包装实验

以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1x106个293T细胞。 1. 取1.5ml灭菌EP管，加入1.5ug包装混合质粒和0.5ug表达质粒以及250ul的无血清培养基。轻柔混匀，室温孵育5min。 2. 取1.5ml灭菌EP管，取9ul 脂质体2000l溶于250ul无血清培养基中。轻柔混匀，室温孵育5min。 3. 将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min 4. 用胰酶消化

慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。慢病毒具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。

慢病毒滴度检测采用稀释计数测定法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。1. 加病毒第二天，准备6个1.5 mL EP管，第一个EP管中加入10 μL病毒原液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度。2. 追加培养液第三天，有需要加puromycin筛选的孔，先

MOI：即 multiplicity of infection，也叫感染复数。很多细胞可以通过文献查阅获取病毒感染的 moi 值。针对无法查询到 MOI 值的细胞可以按照以下步骤进行摸索。

1）合理存放慢病毒，避免反复冻融；2）实验前，摸索确定病毒感染的 MOI；3）对于难感染的细胞进行二次感染；4）加入助转染试剂 polybrene 增大感染效率。

原因：1）保存不当，反复冻融病毒； 2）病毒被污染； 3）细胞传代次数过多，对病毒的易感性下降； 4）病毒适应了细胞株，对病毒的易感性降低； 5）实验操作不一致，如病毒感染时间、感染剂量等不同； 6）病毒超离后重悬病毒的溶剂变化。解决：1）病毒样品根据需要进行分装，避免反复冻融； 2）病毒冻存于 -80 ℃ 保存； 3）每次转染时，选择代数靠的细胞株； 4）统一转染的时间和剂量； 5）统一重悬病毒