克隆中载体的处理和去磷酸化

互联网2013-09-06

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克隆成功与否,除与连接方式以及载体选择有关外，载体的处理也是一个重要环节。为了提高连接效率，处理载体时应注意以下几点：�

(1) 应加入常用量5～10倍的内切酶水解载体，以保证载体被完全酶切；�

(2) 如用双酶切割载体，则必须电泳回收载体片段，除去双酶切所产生的小DNA片段；� (3)如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用

碱性磷酸酶
(如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，防止载体自身环化。
CIP
可以水解掉DNA5末端的磷酸。对于3末端突出的DNA(如

〖ＷＴ５ＢＸ〗Pst〖ＷＴ５ＢＺ〗I水解，需用10倍于5末端突出DNA(如〖ＷＴ５ＢＸ〗Eco〖ＷＴ５ＢＺ〗RI,〖ＷＴ５ＢＸ〗

Hin〖ＷＴ５ＢＺ〗dⅢ)的CIP进行去磷酸化，以达到最少的载体自身环化。

去磷酸方法如下：

①DNA加入10倍去磷酸化缓冲液，5端突出的DNA，每100pmol 5�磷酸基团加入1个单位的CIP，37℃反应30分钟。平末端或3端突出的

DNA，每2pmol 5�磷酸基团加1个单位CIP，37℃保温15分钟后，再加CIP，55℃反应45分钟(2μg 5kb的线性DNA约含14pmol左右的5磷

酸基团)；

②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分别至终浓度05%、 5mmol/L和50μg/ml，混匀后56℃反应30分钟；或加EDTA(pH8.0)至终浓度为

5mmol/L，65℃保温1小时或75℃，10分钟灭活CIP;�

③冷却至室温后，加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次;�

④乙醇沉淀，离心，抽干，溶于无菌去离子水，浓度最好为100μg/ml,-20℃保存备用。〖ＨＴ５Ｈ〗 10倍CIP去磷酸化缓冲液：

〖ＨＴ〗〖JZ(Z〗10 mmol/L ZnCl�210 mmol/L MgCl 2100 mmol/L Tris・HCl,pH8.0。