克隆中载体的处理和去磷酸化
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克隆成功与否,除与连接方式以及载体选择有关外, 载体的处理也是一个重要环节。为了提高连接效率,处理载体时应注意以下几点:
(1)应加入常用量5~10倍的内切酶水解载体,以保证载体被完全酶切;
(2)如用双酶切割载体,则必须电泳回收载体片段,除去双酶切所产生的小DNA片段;
(3)如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶,CIP)处理,防止载体自身环化。
(3)如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶,CIP)处理,防止载体自身环化。
CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸。对于3末端突出的DNA(如【WT5BX】Pst【WT5BZ】I水解,需用10倍于5末端突出DNA(如【WT5BX】Eco【WT5BZ】RI,【WT5BX】Hin【WT5BZ】dⅢ)的CIP进行去磷酸化,以达到最少的载体自身环化。
去磷酸方法如下:
①DNA加入10倍去磷酸化缓冲液,5端突出的DNA,每100 pmol 5磷酸基团加入1个单位的CIP,37 ℃反应30分钟。平末端或3端突出的DNA,每2 pmol 5磷酸基团加1个单位CIP,37 ℃保温15分钟后,再加CIP,55 ℃反应45分钟(2 μg 5 kb的线性DNA约含14 pmol左右的5磷酸基团);
②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分别至终浓度0.5%、 5 mmol/L和50 μg/ml,混匀后56 ℃反应30分钟;或加EDTA(pH8.0)至终浓度为5 mmol/L,65 ℃保温1小时或75 ℃,10分钟灭活CIP;
③冷却至室温后,加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次;
④乙醇沉淀,离心,抽干,溶于无菌去离子水,浓度最好为100 μg/ml,-20 ℃保存备用。【HT5H】10倍CIP去磷酸化缓冲液:【HT】【JZ(Z】10 mmol/L ZnCl2 10 mmol/L MgCl2 100 mmol/L Tris-HCl,pH8.0。