克隆中载体的处理和去磷酸化

克隆成功与否,除与连接方式以及载体选择有关外，载体的处理也是一个重要环节。

为了提高连接效率，处理载体时应注意以下几点：

(1)应加入常用量5～10倍的内切酶水解载体，以保证载体被完全酶切；

(2)如用双酶切割载体，则必须电泳回收载体片段，除去双酶切所产生的小DNA片段；

(3)如粘端连接,单酶切处理过的载体必须用

碱性磷酸酶 (如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，防止载体自身环化。CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸。对于3末端突出的DNA(如PstI水解，需用10倍于5末端突出DNA(如EcoRI,HindⅢ)的CIP进行去磷酸化，以达到最少的载体自身环化。

去磷酸方法如下：

①DNA加入10倍去磷酸化缓冲液，5端突出的DNA，每100pmol 5磷酸基团加入1个单位的CIP，37℃反应30分钟。平末端或3端突出的 DNA，每2pmol 5 磷酸基团加1个单位CIP，37℃保温15分钟后，再加CIP，55℃反应45分钟(2μg 5kb的线性DNA约含14pmol左右的5磷酸基团)；

②加入SDS、EDTA(pH8.0)和蛋白酶K分别至终浓度05%、 5mmol/L和50μg/ml，混匀后56℃反应30分钟；或加EDTA(pH8.0)至终浓度为5mmol/L，65℃保温1小时或75℃，10分钟灭活CIP;

③冷却至室温后，加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次;10 mmol/L ZnCl210 mmol/L MgCl2100 mmol/L Tris・HCl,pH8.0。