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    方案4 离线 micro-IMAC 富集磷酸化蛋白实验

    相关实验：用蛋白质组学方法绘制磷酸化位点图谱

    最新修订时间：

    材料与仪器

    来自目标磷酸化蛋白的多肽
    乙酸铵 EDTA 氯化铁
    接口和组合件 氮压缩气体 IMAC树脂 聚酷亚胺涂层熔融石英毛细管 压力管 聚四氟乙烯管

    步骤

    一、IMAC 微柱的构建制备

    二、磷酸化多肽的富集

    ⑫ 在 200p si的压力下加O lp m o l) 蛋白消化产物（<5/il) 到 IMAC柱上，多 肽混合物应该溶解在水或〇 .〇5mol/L 乙酸中。
    ⑬ 用 0. lmol/L 乙酸在200psi的压力下洗柱子2. 5m i n 。 ⑭ 在 200psi的压力下用水洗柱子2. 5m i n 。 ⑮ 在 200psi的压力下用50m m o l /L N a 2H P O 4 (p H 8 ) 和 乙 酸 铵 （0. 1 % ) 溶液 从柱子上洗脱磷酸化多肽，用微量离心管收集洗脱下来的多肽，直接按照方案5 做 M S /M S 分析。 I M A C 介质的再生 I M A C 柱可以再生，方法如下： ① 在 500psi的压力下用水洗柱子2. 5min; ② 在 500psi的压力下用E D T A (0. lmol/L ) 洗柱子2. 5mi n; ③ 在 500psi的压力下用水洗柱子2. 5min; ④ 在 500psi的压力下用0. lmol/L 乙酸洗柱子2. 5min。 柱子保存于〇.Imol/L 乙酸中，可以重复使用三次，然后丢弃。

    ​

    来源：丁香实验

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