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    方案3 结合固定化金属离子亲和介质和 MALDI-TOF-MS 直接分析方法对磷酸化多肽进行特征分析

    相关实验：用蛋白质组学方法绘制磷酸化位点图谱

    最新修订时间：

    材料与仪器

    试剂、试剂盒
    FeCl3乙酸NH4HCO3MALDI 基质镍-次氨基三乙酸（Ni-NTA)树脂EDTA柠檬酸钠
    仪器、耗材
    微量离心管过滤器MALDI 质谱仪孵育器致密的反应柱子（CRC)MALDI 靶板

    步骤

    一、固定化金属离子亲和柱的制备

    ① 把 C R C 过 滤 器 （35p m ) 插入 C R C ，把 C R C 放人一个标准的微量离心管中。 ② 加 30jul Ni-N T A 树脂浆到C R C 管底部，室温， U O ig•禽心l m i n，排除柱中的 液体。 ③ 用 30沁 100m m o l / L E D T A (p H 8. 0 ) 洗涤 Ni-N T A 树脂，重 复 3 次 ，洗去结 合的 Ni2+〇 ④ 3OlLdH2O 洗柱子，重复3 次。 ⑤ 30jul 100m m o l /L 乙酸洗柱子，重 复 3 次。 ⑥ 用 G a 3+ 或 Fe3+ 使 柱 子 再 生 ，用 30)^1 F e C U (100m m o l /L ) 或 G a C L (60m m o l /L )•洗柱子，重复3 次。 ⑦ 用 30ju1H 2O 洗柱子，重复3 次 ，用 30jLtll00m m o l /L 乙酸洗柱子，重复3 次， 除去未结合的金属离子。

    二、磷酸化多肽与 IMAC 柱的结合

    ⑧ 胰 蛋 白 酶 消 化 磷 酸 化 蛋 白 [蛋 白 与 酶 的 质 量 比 为 20 : (1 〜 100)]，在 50m m o l / L N H 4H C O 3 (p H 8 ) 缓冲液中， 370 C 2h 。 在这些实验中蛋白的浓度为0. ll^g / V U ⑨ 将 2 0 沁 （ 约 20]ug) 经胰蛋白酶消化的磷酸化蛋白与30沁100m m o l /L 乙酸加 到 I M A C 柱上，在慢速转轮上孵育柱子， 37°C 下 30m i n 。 定期检察C R C 柱子底部是否有泄漏，若有泄漏，则可用 Parafilm封 住 C R C 的底部以减少样品漏失。 @用 30^1氏 〇 洗 柱 子 ，接着用30^110〇111]11〇1/1乙酸洗柱子，重 复 3次 ，除去 未与 I M A C 柱结合的多肽。 结合有磷酸化多肽的I M A C 柱 ，可 在 100m m o l /L 乙酸中4°C 下贮存 至少2〜3d 。从复杂混合物如细胞提取物中分离出的磷酸化多肽应该是稳 定的，因为内源性的磷酸酶可以经胰蛋白酶消化和或从柱子上洗脱下来。 为了验证从柱子上洗脱下来的非特异性多肽或未结合的多肽是否为目 标多肽，需用 M A L D I -M S 分析洗脱液。 ⑪ 滴 0. 5沁清洗液和0. 5沁M A L D I 基质于M A L D I 板上。

    三、碱性磷酸酶处理亲和结合的磷酸化多肽

    ⑫ 将 结 合 于 I M A C 基 质 （ 来自第⑩步）上的磷酸化多肽，与 5W 50m m 〇 l/L N H 4H C O 3 (pH7.8 ) 和 I U 的牛小肠碱性磷酸酶，在一个〇.7m l 的微量离心管中混合。 ⑬ 在慢速转轮上孵育微量离心管， 37°C 下 30m i n 。 ⑭ 控制消化的时间进程，定 期 将 0.5沁 反 应 混 合 物 （ 上清和珠子）和 0.5W 的
    M A L D I 基质点到M A L D I 板上，从第⑬ 步开始后3〇 m i n 开始检测。最 初每 3〇min间 隔取样检测，根据蛋白质的性质不同，碱性磷酸酶的孵育时间可以从^到过夜。

    四、羧肽酶 Y 消化亲和结合的磷酸化多肽

    ⑮ 将 25W 结 合 于 I M A C 基 质 （ 来自第⑩步）上的憐酸化多肽转移到另一个 C R C 上。 ⑯ 用 30^x1 50m m o l / L 梓 檬 酸 钠 （ p H 6 ) 洗 柱 子 ,重 复 3 次。 @ , 加 40ju 50m m o l /L 梓 檬 酸 钠 （ p H 6 ) 到柱子上。 ⑬ 加 羧 肽 酶 Y (溶于水中， ll^g/jul) 到柱子上。 ⑲ 在慢速转轮上37° C 下孵育微量离心管。 根据蛋白质的性质不苘，羧肽酶Y 消化的时间可以从几分钟到过夜。 这样消化的时间进程（ 第⑩步）刚开始时应该在每30〜60s 的时间间隔内 监控一次。 ⑳ 反应的时间进程控制： a . 用 5〇 4 1 0 0 m m o l / L 乙酸洗珠子，重 复 三 次 ； b . 加 30pl 1 0 0 m m o l / L 乙酸； c. 点 0. 5 0 珠子和0. 5沁 M A L D I 基 质到 M A L D I 板上，用 作 M A L - DI-M S 分析； d. 重复第⑯ 〜⑲ 步继续进行脱羧酶消化反应。

    五、质谱

    ㉑ 对来自第⑪ 、 ⑭ 和⑳ a. 步的样品用延迟提取装置T O F 质谱做M A L D I 分析


    ​

    来源：丁香实验

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