DNA结合蛋白的磷酸化研究

磷酸化化学计量的确定及磷蛋白形成动力学的测定

l      磷酸化作用化学计量的确定

1． 在冰上建立下列反应混合液：

Tris-HCl （ 50mmol/L ； pH8.0 ） /MgCl₂ （ 10mmol/L ）         250 μ l

ATP （ 10mmol/L ）                                        1 μ l

纯化的 DNA 结合蛋白（ 1mg/ml ）                          4 μ l

[ γ ^-32 P]ATP （ 13 μ Ci ）                                  1.3 μ l

2． 将反应液混合物分成 125 μ l 的两个部分，记为 A 部分和 B 部分。 B 部分将被用于动力学实验。

3． 在 6 个干净管中各加入 20 μ l A 部分溶液，然后各管中依次加入 0 ， 0.5 ， 1 ， 2 ， 3 和 4 微单位的蛋白激酶以开始磷酸化测试。室温下反应 30 分钟。

4． 将 10 μ l 每一磷酸化测试混合液点在一张 2cm × 2cm 的 Whatman 3MM 滤纸上，将该滤纸在 10 ％ TCA/1% 焦磷酸钠溶液中洗 10 分钟（每张滤纸用 5ml 溶液）。更换溶液重复洗两次。用 100 ％乙醇洗滤纸。通过对每张滤纸所发出放射性的计数来确定每个样品中磷蛋白的掺入量。

5． 在每个管中加入 1.1 μ l 100 ％ TCA 以沉淀管中剩余的 10 μ l 磷酸化测试混合液。在冰上放置 20 分钟，室温下用微型离心机在 10 000r/min 离心 10 分钟以收集蛋白质沉淀。先用 90 ％后用 100 ％丙酮洗沉淀。在空气中干燥沉淀 5 分钟。

6． 将样品加到 SDS －聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，在 160V 下 1 ×电泳缓冲液（ 10 ×贮液配制）中电泳 40 分钟。用 Saran® 膜包裹湿胶，对 X 光片曝光 3 小时左右。

7． 以放射自显影胶片为模板，切下与 DNA 结合蛋白相对应的被标记的条带。用 5 倍体积 30 ％过氧化氢在 37 ℃处理凝胶条带 6 ～ 12 小时以溶解 DNA 结合蛋白。通过对每个样品的契仑科夫放射的计数来确定磷蛋白的掺入量。

8． 用以下两种方法测定待测液中的总掺入量：

a． 将 9 μ l 分析缓冲液（ 50mmol/L Tris-HCl pH8.0/10mmol/L MgCl₂ ）加到 1 μ l A 部分溶液中，将混合液点在一张 2cm × 2cm 的 Whatman 3MM 滤纸上。不要用 TCA 处理滤纸。对滤纸所发出的放射性进行计数。

b． 将 1 μ l A 部分溶液加到适当体积的 30 ％过氧化氢溶液中，并对契仑科夫放射性进行计数。

9． 计算掺入到蛋白质中的磷酸的莫尔数。在本实验中，每个分析包含 800 pmol ATP 和 8 pmol （ 0.3 μ g ）蛋白（如果待测 DNA 结合蛋白是 GBF1 的话，其分子量为 37 000 ）。 1 ％掺入蛋白中的放射性相当于每莫尔蛋白含有 1 摩尔磷酸。

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l      磷蛋白形成动力学的测定

1． 向 B 部分中加入 18 微单位蛋白激酶并在室温下放置。在第 0 ， 5 ， 10 ， 20 ， 25 和 30 分钟时各取 20 μ l 试样。取出后立即终止磷酸化反应，取其中 10 μ l 点在一张 2cm × 2cm 的 Whatman 3MM 滤纸上，并用 TCA 处理，剩余 10 μ l 用 1.1 μ l 100 ％ TCA 沉淀。

2． 来自 B 部分样品的处理方法与 A 部分相同。

3． 确定磷蛋白形成的速率。

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l      变性 SDS －聚丙烯酰胺凝胶的制备

磷酸化反应洗滤纸时是制胶的良机。

1． 依次混合下列组分以配制 10 ％丙稀酰胺分离胶溶液：

丙稀酰胺 / 双丙稀酰胺（ 30 ％）                                3.38ml

Tris-HCl （ 1mol/L; pH8.8 ）                                   3.80ml

SDS （ 10 ％）                                               0.10ml

加水至 10ml 。加入 50 ％ APS 12 μ l 和 TEMED 10 μ l ，重复混匀（这些足以灌制两块 8.3cm × 7.4cm × 0.075cm 的微型凝胶）。将溶液注入灌胶的平板夹层中使其充满两块平板间空隙的 80 ％，用水覆盖凝胶，静置 10 分钟使凝胶聚合。吸去水层。

2． 依次混合下列组分以配制 4 ％丙稀酰胺浓缩胶溶液：

丙稀酰胺 / 双丙稀酰胺（ 30 ％）                              0.27ml

Tris-HCl(1mol/L; pH6.8)                                 0.25ml

甘油                                                     0.20ml

SDS （ 10 ％）                                               20 μ l

加水至 2ml ，再加入 50 ％ APS 2.4 μ l 和 TEMED 2 μ l ，并将溶液加到分离胶上至低于矮平板上沿 5mm 处，插上梳子。该胶可在室温下存放数小时或装在密封的塑料袋中于 4 ℃放置数天备用。

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用放射性标记的磷蛋白和非标记的 DNA 探针进行迁移率变动分析：磷酸化蛋白与 DNA 的结合

l        迁移率变动测定

1． 将 2 μ l 近似饱和磷酸化的 DNA 结合蛋白加入到 110 μ l 未用 poly(dI-dC) 配制的迁移率变动缓冲液中。

2． 取 20 μ l 到一个干净管中作为对照（样品 1 ），在剩余 92 μ l 中加入 poly(dI-dC) 至终浓度为 0.07 μ g/ μ l ，并取出 4 份各 20 μ l 的等分试样（样品 2 ～ 5 ）。

3． 分别在样品 2 ， 3 和 4 中加入 0 ， 2 和 10ng 非标记的 DNA 探针，在样品 5 中加入 0.1 μ g 超声处理的鲑精 DNA ，并将样品 1 ～ 5 于室温放置 30 分钟。

4． 在每个样品中加入 5 μ l 非变性上样缓冲液，并将样品加到非变性聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中，以低于 100V 的电压在 1 ×电泳缓冲液中电泳 3 小时。用 Saran® 膜包裹湿胶，对 X 光片过夜曝光。更好的方法是在 Whatman 3MM 滤纸上干燥凝胶，加 Kodak 增感屏对 X 光片曝光。

l      非变性聚丙烯凝胶的制备

在结合分析反应时倒胶比较合适。

1． 依次混合下列组分以配制 4 ％非变性丙稀酰胺凝胶溶液：

丙稀酰胺 / 双丙稀酰胺（ 30 ％）                                   6.6ml

电泳缓冲液（ 10 ×）                                             5ml

加水至 50ml ，并加入 50 ％ APS 60 μ l 和 TEMED 50 μ l 。

2． 充分混匀，将溶液倒入垂直凝胶电泳装置的平板夹层中（ 14.5cm × 17cm × 0.2cm ）。本方法不需浓缩胶，因为分离胶具有自浓缩作用。聚合约需 10 分钟。该胶可浸泡在 1 ×电泳缓冲液中于 4 ℃保存数周备用。