免疫亲和层析的操作方案

一、免疫亲和层析程序方案概述

1. 将抗体与基质（微珠）共价交联并制备抗体亲和层析柱。

先将单克隆抗体或经过亲和层析纯化的多克隆抗体以共价方式交联到固相基质（微珠）上。除特殊情况外，一般不使用未经纯化的多抗，因为从多抗层析柱上洗脱抗原非常困难，通常需要以适当的条件先使抗原变性。

抗体以共价方式交联到固相基质上有很多不同的方案，将抗体交联到蛋白A或蛋白G微珠上可能最简单。另一种方法是将抗体共价交联到具有活性基团的微珠上。

2. 将抗原结合到抗体-微珠基质上。

在抗体-微珠基质制备好后，将抗原结合到抗体上，然后通过洗涤去除其他的大分子物质。

3. 抗原的洗脱。

用适当苛刻的洗脱条件处理免疫复合物，降低抗体与抗原结合的亲和力，抗原即被释放到洗脱液中。

二、抗体亲和层析柱的制备

将抗体以共价方式交联到固相基质上有很多方法，其中最实用的有两种方案：

①最常用的基质为蛋白A或蛋白G微珠，蛋白A或蛋白G可与抗体的Fc段特异性结合。当抗体被结合后，用一种双功能结合剂使抗体与蛋白A或蛋白G交联，使其相互作用保持稳定；

②第二类交联方法是将抗体直接与一种活性微珠交联。这种微珠经过化学方法活化使其表面具有活性的反应基团。将微珠与纯化的抗体混合，二者通过与活性部位相互作用而共价连接。

在这两种方案中，用于结合抗体的微珠都有商品化试剂供应。虽然活性微珠可以在实验室制备，但购买的产品性能良好而且价廉。

上述两种方案的优缺点见表。如果以前未使用过此类方法，可选择蛋白A或蛋白G层析柱进行预试。

抗体与微珠结合的方法