荧光免疫层析

想求助一下，我用EDC/NHS活化法将抗体偶联到荧光微球上，想测试一下有没有偶联成功，将划好的NC膜底端插入偶联好的荧光微球溶液中，一开始一条线都没有，过了半小时左右C线才开始明显，当我把它做成免疫层析试纸条再测试的时候还是一条线都没有，这种情况是这么回事，抗体和荧光微球有没有偶联成功呢