免疫亲和层析的基本过程

一．概要

对蛋白质（抗原）的纯化率为1000~10000倍。

快速纯化抗原，层析柱一般可重复使用。

可获得纯化的抗原。

不能用于定量测定。

纯化效果取决于待纯化抗原的浓度和抗体的亲和力。

需要适当纯化的抗体。

二．操作步骤

基本步骤为：交联 → 结合 → 洗脱

1. 交联

①将抗体结合到蛋白A或蛋白G微珠上。一般情况下，每毫升湿的微珠大约可以结合2mg单克隆抗体或经亲和层析纯化的多克隆抗体。将抗体和蛋白A或G微珠混合成为稀薄的匀浆，在总量为10m1的溶液中加入大约1ml微珠，室温孵育1 h，轻轻摇动混匀。

②用10倍体积的 0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)洗涤微珠2次，每次以3000′g离心2min，或10000′g离心30s。

③用10倍体积的0.2mol/L硼酸钠(pH9.0)重悬微珠，留取相当于10ml湿微珠的样品。加入足量的二甲基庚二酸酯(固体)至微珠匀浆中，使终浓度为20mmol/L。

④室温孵育30min，使结合在蛋白A或G微珠上的抗体与微珠基质发生交联。并轻轻混匀。留取相当于10ml交联微珠的样品。

⑤用0.2mol/L乙醇胺（pH8.0)洗涤微珠1次以终止交联反应。然后将其重悬于0.2mol/L乙醇胺溶液中，室温孵育2h，轻轻混匀。微珠用PBS洗涤后，重悬于PBS，加入硫柳汞保存。

⑥将交联前和交联后的微珠样品加入Laemmli样品缓冲液中煮沸后，检查交联效果：分别取相当于1ml和9ml两份样品在10％SDS－聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并用考马斯亮兰染色，如果交联效果良好，在交联前的微珠样品中显示一条55kDa的重链条带，而交联后的样品无此条带。

2. 结合

①将抗体交联的微珠转入合适的层析柱中，用PBS冲洗容器，收集残留的微珠。如果可能，仅使用待纯化制品中全部抗原所需的抗体微珠基质。

②用20倍柱床体积与待纯化抗原溶液相同的缓冲液洗柱。

③将待纯化抗原溶液加入层析柱，按每毫升柱体积大约1m1/h的流速，使抗原溶液流过层析柱，用蠕动泵控制流速。

④ 用20倍柱床体积的结合缓冲液（即PBS）洗柱。

3. 洗脱

①用20倍柱床体积的预洗脱缓冲液洗柱。参见表2-5建议使用的预洗脱缓冲液。

②采用分段洗脱法，连续以0.5倍柱床体积的洗脱缓冲液(表2-5)通过层析柱，分管收集每一组分。如果使用过高或过低pH值的缓冲液洗脱，收集管内需加入0.1柱床体积的中和缓冲液(参见表2-5)

③检测每管的抗原含量，将浓度高的各管合并。根据抗原的用途，需对收集的抗原洗脱液透析。

④ 用20倍柱床体积的起始缓冲液流经基质，使层析柱再生。加入0.01％硫柳汞可长期保存于4℃的环境中。