材料与仪器
免疫亲和介质 溴化氰（CNBr) 活化的 Sepharose 4B HCl 55% 饱和 AMS 沉淀物 偶联缓冲液 乙醇胺 缓冲液 B LAC 洗脱缓冲液 二硫苏糖醇 硫氰酸钾 叠氮钠
Econo-柱 SDS-PAGE 电泳装置
Econo-柱 SDS-PAGE 电泳装置
步骤
材料与设备
免疫亲和介质（带固定化的 MAb NT73; 见下文)
溴化氰（CNBr) 活化的 Sepharose 4B(Sigma Chemical Co.C 9142)
HCl(1 mmol/L)
55% 饱和 AMS 沉淀物（见 p.154)
Econo-柱 (Bio-Rad Laboratories)
SDS-PAGE 电泳装置
试剂
偶联缓冲液
乙醇胺（1mol/L)
缓冲液 B
LAC 洗脱缓冲液
二硫苏糖醇（DTT)(0.1mol/L)
硫氰酸钾（KSCN)(2mol/L)
叠氮钠（2%)
(配方，见「试剂的配制 pp.l84~189)
操作程序
免疫亲和介质的制备和保存
本操作所用的产 MAb 的小鼠杂交瘤是按标准方法（见 Harlow 和 Lane,1988) 制备的。MAb 是用 45% 饱和 AMS 沉淀，并利用它们在 pH7.0、25 mmol/L NaCl 条件下不能与 DEAE-纤维柱结合的性质，从小鼠腹水纯化得到的。在上述条件下，许多小鼠 IgG MAb 可经 DEAE 柱流出，所得 MAb 制备物的纯度大于 80%, 已适于作免疫亲和层析（许多纯化 MAb 用的方法，可参见 Harlow 和 Lane,1988)。MAb 可共价偶联于经溴化氰（CNBr) 活化的 Sepharwse 上，所用方法概述如下，亦可参见 Pharmacia 出版物 Affinity Chromatography:Principles and Methods (Pharmacia LKB Biotechnology,1993)。
1) 取 1 gCNBr 活化的 Sepharose4B 胶（体积约 3.5 ml) 浸泡于 1 mmol/LHCl 溶胀并洗涤。
2) 将溶于偶联缓冲液的约 10 mg MAb 与洗涤过的 Sepharose 4B 胶在室温下混合 2 h。
3) 室温下将 Sepharose 4B 胶置 1md/L 乙醇胺中 2 h, 封闭胶上残存的活性基团。
4) 洗去多余的蛋白质和封闭剂。在正常情况下，每毫升装柱的免疫亲和介质含 2~3 mg 共价偶联的 MAb。免疫亲和介质 4°C 保存于含 0.02% 叠氮钠的缓冲液中，以防细菌生长。
免疫亲和层析
在本实验中，用免疫亲和柱结合核心 RNA 聚合酶和各种结合的σ因子。由于σ32 在出发细胞中是过量生产的，因此大多数核心 RNA 聚合酶都含有结合的σ32（在正常情况下，σ32 可能只是 RNA 聚合酶的次要成分)。核心 RNA 聚合酶-σ32 复合物呈酸性，可用
PEI 进行沉淀。
1) 使用前取 2 ml 免疫亲和介质浆状物重悬于 10 ml 缓冲液 B 中洗涤。室温下 1000r/min 离心 1~2 min。离心操作必须轻缓，因为在高速下离心力会把胶压碎。重复此步操作一次。这样洗两次可除去叠氮钠和在储存时从胶上沥出的 MAb。
2) 将 55% 饱和 AMS 沉淀物溶于 20 ml 缓冲液 B 中，室温下 13000r/min 离心 10 min, 去除所有不溶物（如有沉淀，其量亦应极少)。留上清，取样（样品 I)。
3) 将溶解的澄清的 AMS 沉淀液加于沉淀的 Sepharose 4B 胶中，室温下缓缓摇动混合 30 min。
方案补充实验：于 0、5、15 和 30 min 时各取样品 100ul。各样品立即离心，并取上清作 SDS-PAGE 分析，以确定蛋白质与免疫亲和介质结合需要多长时间（见 p.178)。
注：与免疫亲和介质接触的必须是只含低浓度还原剂（DTT) 的缓冲液，否则，免疫球蛋白 G(IgG) 的二硫键会被还原，从而导致 IgG 重链和轻链从介质上脱落。为此，我们用缓冲液 B(不含 DTT)。RNA 聚合酶在不含 DTT 的缓冲液中虽能短暂存活，但应尽快将 DTT 回加于柱层析组分中。这很容易做到，于每个空的组分管中预置 lul 0.1mol/L DTT 即可。去掉缓冲液 B 中 5% 的甘油；如有甘油存在，洗柱时，有些酶会因此步操作中所用 MAb 的多元醇应答性而从柱上洗脱下来。
4) 缓缓离心，离下层析介质，弃上清（IAC 穿过液)，将介质重悬于 10 ml 缓冲液 B 中，再注入 Bio-Rad Econo 柱中。
5) 收集 10 ml 穿过液（第 1 次洗柱)，加 5 ml 以上缓冲液 B, 再收集 5 ml 穿过液 (第 2 次洗柱)。
注：洗涤介质和从介质上洗脱σ因子可在试管中以分批方式进行试验，加人合适的缓冲液，缓缓地混合 15~30 min, 再将介质缓缓离心下来。尽管在分批方式中能较有效地使 a32 因子结合于介质及去除未结合的物质，但随后的洗涤和洗脱仍在一根柱上进行。当介质置于洗脱缓冲液中时，σ32 就会从抗体上解离下来，但必须以三维无规行走 (three-dimensinal random walk) 的方式从 100um 大的 Sepharose 微珠中扩散出来，这需要很长时间。而σ32—旦「走」出微珠，就会较有效地从微珠上洗脱下来，如果缓冲液在柱式 (column mode) 层析中是从旁流过的话。
6) 在室溫下，每次给柱加 lmlIAC 洗脱缓冲液，共 10 次，分别收集各组分于含 lul 0.1mol/L DTT 的 Eppendorf 管中。将各组分（1~10 管) 放置于冰上，用快速蛋白质斑点印迹（Westerndotblot) 或 SDS 凝胶电泳分析测定，以确定哪几管组分可以合并。
注：IAC 洗脱缓冲液的密度大于缓冲液 B 中的免疫亲和介质。加入时可能会损坏柱子介质上浮！）。因此，必须在洗柱结束时让柱介质顶部略向下压紧，再极缓谩地加人第一次 1-ml 洗脱缓冲液（最好先加 200ul, 待其下沉后，再慢慢加入其余部分)。如加粘的洗脱缓冲液时柱的流速变慢，则可在柱的底部接一根 6~10 cm 长的塑料管，以增加静水压，促使缓冲液流过柱子。
7) 柱子使用后，用 2mol/LKSCN(—种强的离液序列高的变性盐，它不会使抗体不可逆失活处理柱子，以去除残留的非共价结合的蛋白质。再用缓冲液 B 洗柱，并将其 4°C 保存于含 0.02% 叠氮钠的缓冲液 B 中。如柱子得到细心的清洗和保存，则可反复使用几十次。
POROS 50 Q 阴离子交换层析（可选用）
欲获得纯度更高的核心 RNA 聚合酶-σ32 复合物，可用 50 mmol/L Tris(PH7.9) 将 IAC 柱的峰组分稀释 10 倍，把丙二醇降至 3%,NaCl 浓度降至 0.075mol/L。经稀释的样品还可进行离子交换层析, 方法如 PP.149~151 所述，除用 POROS 50Q 柱代替 FOROS 50S 柱者外。最后合并的组分对储存缓冲液（缓冲液 A+50% 甘油）进行透析。如 P.151 所述。
免疫亲和介质（带固定化的 MAb NT73; 见下文)
溴化氰（CNBr) 活化的 Sepharose 4B(Sigma Chemical Co.C 9142)
HCl(1 mmol/L)
55% 饱和 AMS 沉淀物（见 p.154)
Econo-柱 (Bio-Rad Laboratories)
SDS-PAGE 电泳装置
试剂
偶联缓冲液
乙醇胺（1mol/L)
缓冲液 B
LAC 洗脱缓冲液
二硫苏糖醇（DTT)(0.1mol/L)
硫氰酸钾（KSCN)(2mol/L)
叠氮钠（2%)
(配方，见「试剂的配制 pp.l84~189)
操作程序
免疫亲和介质的制备和保存
本操作所用的产 MAb 的小鼠杂交瘤是按标准方法（见 Harlow 和 Lane,1988) 制备的。MAb 是用 45% 饱和 AMS 沉淀，并利用它们在 pH7.0、25 mmol/L NaCl 条件下不能与 DEAE-纤维柱结合的性质，从小鼠腹水纯化得到的。在上述条件下，许多小鼠 IgG MAb 可经 DEAE 柱流出，所得 MAb 制备物的纯度大于 80%, 已适于作免疫亲和层析（许多纯化 MAb 用的方法，可参见 Harlow 和 Lane,1988)。MAb 可共价偶联于经溴化氰（CNBr) 活化的 Sepharwse 上，所用方法概述如下，亦可参见 Pharmacia 出版物 Affinity Chromatography:Principles and Methods (Pharmacia LKB Biotechnology,1993)。
1) 取 1 gCNBr 活化的 Sepharose4B 胶（体积约 3.5 ml) 浸泡于 1 mmol/LHCl 溶胀并洗涤。
2) 将溶于偶联缓冲液的约 10 mg MAb 与洗涤过的 Sepharose 4B 胶在室温下混合 2 h。
3) 室温下将 Sepharose 4B 胶置 1md/L 乙醇胺中 2 h, 封闭胶上残存的活性基团。
4) 洗去多余的蛋白质和封闭剂。在正常情况下，每毫升装柱的免疫亲和介质含 2~3 mg 共价偶联的 MAb。免疫亲和介质 4°C 保存于含 0.02% 叠氮钠的缓冲液中，以防细菌生长。
免疫亲和层析
在本实验中，用免疫亲和柱结合核心 RNA 聚合酶和各种结合的σ因子。由于σ32 在出发细胞中是过量生产的，因此大多数核心 RNA 聚合酶都含有结合的σ32（在正常情况下，σ32 可能只是 RNA 聚合酶的次要成分)。核心 RNA 聚合酶-σ32 复合物呈酸性，可用
PEI 进行沉淀。
1) 使用前取 2 ml 免疫亲和介质浆状物重悬于 10 ml 缓冲液 B 中洗涤。室温下 1000r/min 离心 1~2 min。离心操作必须轻缓，因为在高速下离心力会把胶压碎。重复此步操作一次。这样洗两次可除去叠氮钠和在储存时从胶上沥出的 MAb。
2) 将 55% 饱和 AMS 沉淀物溶于 20 ml 缓冲液 B 中，室温下 13000r/min 离心 10 min, 去除所有不溶物（如有沉淀，其量亦应极少)。留上清，取样（样品 I)。
3) 将溶解的澄清的 AMS 沉淀液加于沉淀的 Sepharose 4B 胶中，室温下缓缓摇动混合 30 min。
方案补充实验：于 0、5、15 和 30 min 时各取样品 100ul。各样品立即离心，并取上清作 SDS-PAGE 分析，以确定蛋白质与免疫亲和介质结合需要多长时间（见 p.178)。
注：与免疫亲和介质接触的必须是只含低浓度还原剂（DTT) 的缓冲液，否则，免疫球蛋白 G(IgG) 的二硫键会被还原，从而导致 IgG 重链和轻链从介质上脱落。为此，我们用缓冲液 B(不含 DTT)。RNA 聚合酶在不含 DTT 的缓冲液中虽能短暂存活，但应尽快将 DTT 回加于柱层析组分中。这很容易做到，于每个空的组分管中预置 lul 0.1mol/L DTT 即可。去掉缓冲液 B 中 5% 的甘油；如有甘油存在，洗柱时，有些酶会因此步操作中所用 MAb 的多元醇应答性而从柱上洗脱下来。
4) 缓缓离心，离下层析介质，弃上清（IAC 穿过液)，将介质重悬于 10 ml 缓冲液 B 中，再注入 Bio-Rad Econo 柱中。
5) 收集 10 ml 穿过液（第 1 次洗柱)，加 5 ml 以上缓冲液 B, 再收集 5 ml 穿过液 (第 2 次洗柱)。
注：洗涤介质和从介质上洗脱σ因子可在试管中以分批方式进行试验，加人合适的缓冲液，缓缓地混合 15~30 min, 再将介质缓缓离心下来。尽管在分批方式中能较有效地使 a32 因子结合于介质及去除未结合的物质，但随后的洗涤和洗脱仍在一根柱上进行。当介质置于洗脱缓冲液中时，σ32 就会从抗体上解离下来，但必须以三维无规行走 (three-dimensinal random walk) 的方式从 100um 大的 Sepharose 微珠中扩散出来，这需要很长时间。而σ32—旦「走」出微珠，就会较有效地从微珠上洗脱下来，如果缓冲液在柱式 (column mode) 层析中是从旁流过的话。
6) 在室溫下，每次给柱加 lmlIAC 洗脱缓冲液，共 10 次，分别收集各组分于含 lul 0.1mol/L DTT 的 Eppendorf 管中。将各组分（1~10 管) 放置于冰上，用快速蛋白质斑点印迹（Westerndotblot) 或 SDS 凝胶电泳分析测定，以确定哪几管组分可以合并。
注：IAC 洗脱缓冲液的密度大于缓冲液 B 中的免疫亲和介质。加入时可能会损坏柱子介质上浮！）。因此，必须在洗柱结束时让柱介质顶部略向下压紧，再极缓谩地加人第一次 1-ml 洗脱缓冲液（最好先加 200ul, 待其下沉后，再慢慢加入其余部分)。如加粘的洗脱缓冲液时柱的流速变慢，则可在柱的底部接一根 6~10 cm 长的塑料管，以增加静水压，促使缓冲液流过柱子。
7) 柱子使用后，用 2mol/LKSCN(—种强的离液序列高的变性盐，它不会使抗体不可逆失活处理柱子，以去除残留的非共价结合的蛋白质。再用缓冲液 B 洗柱，并将其 4°C 保存于含 0.02% 叠氮钠的缓冲液 B 中。如柱子得到细心的清洗和保存，则可反复使用几十次。
POROS 50 Q 阴离子交换层析（可选用）
欲获得纯度更高的核心 RNA 聚合酶-σ32 复合物，可用 50 mmol/L Tris(PH7.9) 将 IAC 柱的峰组分稀释 10 倍，把丙二醇降至 3%,NaCl 浓度降至 0.075mol/L。经稀释的样品还可进行离子交换层析, 方法如 PP.149~151 所述，除用 POROS 50Q 柱代替 FOROS 50S 柱者外。最后合并的组分对储存缓冲液（缓冲液 A+50% 甘油）进行透析。如 P.151 所述。
来源：丁香实验
