磷酸化蛋白鉴定实验

植物学实验

最新修订时间：2023-07-10

简介

可逆的蛋白质的磷酸化作用参与植物细胞生理学的所有活动。由于用于研究磷酸化蛋白质的蛋白质组学和质谱技术的应用，使得这项具有高度挑战性的任务—揭示和分析植物中动态蛋白磷酸化网络的工作最近才开始成为可能的。本实验来源「植物蛋白质组学实验指南」〔法〕H.蒂勒门特、M.齐维、C.达默韦尔、V.米琴主编。

来源：丁香实验

操作方法

磷酸化蛋白鉴定

这里所述的方法概括为下列几个步骤：胰蛋白酶水解消化膜和可溶性组分中的蛋白质（见 24. 3.1 )；固相金属螯合亲和层析（IMAC) 富集磷酸肽（见 24. 3. 2 )；用串联质谱对磷酸肽进行鉴定和测序（见 24. 3. 3 )；使用稳定同位素标记的磷酸肽的相对定量分析（见 24.3.4 )；用液相色谱-质谱（LC- MS) 确定蛋白磷酸化率（见 24.3. 5 ) 。 3.1 细胞亚组分的胰

蛋白质磷酸化

1、步骤见 Western blot；2、步骤见 ELISA；3、步骤见原 protocol。

western blot 检测蛋白激酶磷酸化水平

蛋白质磷酸化属于蛋白质翻译后修饰，是细胞信号转导过程中常见的一种修饰方式，常常用来调节蛋白的活性、构象和相互作用等生物学功能。真核生物中常见的磷酸化发生于丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和组氨酸残基上。研究蛋白的磷酸化状态对于理解细胞生物学过程具有重要意义。检测蛋白质磷酸化水平的方法有蛋白质免疫印迹（Western blotting）ELISA 酶联免疫反应、细胞免疫化学（ICC）、流式细胞术和磷酸化抗体芯