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WESTERN BLOT检测蛋白

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6035

与DNA的Southern blot印迹相对应,蛋白质分析中应用的Western blot印迹技术也是通过对目标组分电泳分离,并转移至固相支持物(硝酸纤维膜),利用特异抗体作为探针,对靶物质进行检测。
蛋白质的Western blot结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫检测的特异敏感等多种优点,可检测到低至1-5ng中等大小的靶蛋白。

【试剂】
转移缓冲液: 25mM Tris-Cl, 192mM甘氨酸,20%甲醇(v/v), 0.01%SDS, pH8.3
漂洗液: PBS-Tween 20
150mM NaCl, 10mM Tris-Cl(pH7.4), 0.05% Teeen-20(v/v)
封闭液: 5%脱脂奶粉或3%BSA溶于10mM PBS-Tween 20
一抗: 特异的单克隆或多克隆抗体
酶标二抗
底物液:5mg DAB/ml 溶于0.05M柠檬酸-磷酸盐缓冲液(pH5.0)

【操作方法】
1.剪6张与电泳凝胶大小一致的Watman 3MM滤纸和1张硝酸纤维膜(NC),带手套操作。
2.将上述滤纸及NC膜,浸入双蒸水中,再浸泡转移液中。
3.凝胶用双蒸水漂洗2次,再用转移液漂洗10分钟,2次。
4.按图示装好凝胶与NC膜,注意NC膜的药膜面朝向凝胶,膜与凝胶之间无气泡。
5.将装好的胶板插入转移槽中,注意NC膜位于阳极侧。
6.槽中加转移液,使之漫过铂金丝,接好冷却水系统。
7.电泳:6-10v/cm (电极距离),1-16小时(依据转移效果)。
8.电泳完毕后,取出NC膜,用铅笔做好标记,漂洗液洗3次,每次5分钟。
9.封闭: 将NC浸入封闭液中1小时或4℃过夜。用漂洗液洗3次,每次5分钟。
10.将NC膜切成小条,放入反应槽中,加入稀释好的一抗,同时做阴阳对照。室温反应2小时,或4℃过夜。振荡漂洗3次,每次10分钟。
11. 加酶标二抗,室温反应1-2小时,振荡漂洗3次,每次10分钟。
12. 显色:加入底物液,至蛋白带清晰为止。
13. 终止反应: 水漂洗。

【转移事项】
1. 电泳毕可用含0.2%丽春红S的3%冰醋酸水溶液染NC膜,来观察转移结果和标准蛋白位置。 或用考马斯亮蓝染凝胶来观察转移效果。
2. 酶标二抗可以是IgG, IgM, IgA. 也可用酶标的SPA蛋白。
3.转移好的NC膜,如不接着做酶标反应,可在封闭后,漂洗,晾干,封于塑料袋中,4℃保存备用。

生物秀Western Blotting专题:
http://ask.bbioo.com/special/experiment/WesternBlotting.htm

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