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科研学霸天团,48小时有问必答
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如何判断pcr样本是否污染,怎么避免?
dxy_g9y5gije
pcr样本污染是指模板污染还是整个体系污染呢如果是体系,那么做好阴性克隆和阳性克隆就可以判断如果是模板的话,考虑重新获取模板比对
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问
构敲降质粒,测序结果比对,两个酶切位点和载体序列都对上了,只有合成的敲降序列后半段不对 。是单链退火有问题还是公司合成的序列不对
天一湖医者
序列的方向需要验证,因为TA是随机插入到载体里面的。所以先用一个载体引物和你的insert引物配对检测得到正确方向插入的clones。
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问
做了三次qpcr独立重复,前两次都有相同趋势,第三次出现了严重反差,实验过程是没问题的操作也很严谨,这种情况要怎么办呢
dxy_g9y5gije
遇到这种情况建议详细记录实验过程再次尝试,因为导致这种结果出现的情况太多了,需要逐一排除
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问
当PCR产物有两条带的时候,怎么才能快速提高特异性?
Miracle星
出现多条条带表示PCR反应的特异性不高,可以进行如下优化尝试:1.适当提高PCR的退火温度。退火温度越高,DNA分子之间的配对越困难。这样可以减少引物与模板之间非特异性的结合。2.检查一下引物的Tm值和序列结构,如果引物Tm值过高,上下游引物Tm值相差太大,或者引物单链易形成高级结构,都不利于PCR反应。必要时重新设计引物。3.检查一下模板纯否。模板越纯,条带越特异。反之模板杂乱(例如cDNA文库
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问
引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?
dxy_j7jezao0
与它的纯化回收方式有关,更换其它高纯度纯化方式
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问
我是要扩增一个片段,加上双酶切位点,片段就那么大,我就需要那么大加酶切位点?这引物怎么设计?是不是只要5‘端序列,以及3’端的反
dxy_j7jezao0
5'端加上酶切位点不影响你扩增目的片段,网上用软件设计可以直观作出对引物的评价。你也可以自己设计,符合一些引物设计原则就好
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问
我设计的引物为:上游引物:TCC CCCGGG ATGGCTCCACTTCACGAATC下游引物:ATAAGAAT GCGGCC
bamboopiggy
你能不能换个酶?你选的这两个酶,全是GC的,本身就会导致TM值升高,再加上上游起始序列中GC含量也比较高,所以你换个酶比较合适。
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问
普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别
dxy_j7jezao0
qPCR为保证扩增效率,产物片段较小,70-250bp,TM值一般60左右其他差别较小
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问
实时荧光定量PCR 的引物能不能用来做RT
dxy_j7jezao0
下游引物可以,这就是RT中所说的特异引物
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问
荧光定量PCR熔解曲线出现多峰是什么原因?怎么解决?
bamboopiggy
一般情况是引物不特异,可能有多个产物。不能用,换个引物。
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问
PCR实验中菌落PCR检测有条带,接种大摇后无条带
bamboopiggy
一般菌落pcr,可能会存在插入片段也转入菌种,但是没有和载体连接成功。所以一般做完菌落pcr以后,先要送测序,测序成功,才大摇比较合适。
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问
PCR实验中扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
bamboopiggy
可能产物不特异,出现多条带,但是片状弥散,可以考虑灌胶不匀,尤其是在胶中直接加入EB或GV的情况下
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问
请问 PCR引物长度24点情况下,错配几个碱基仍能P出来、基本不影响效率?
dxy_j7jezao0
不确定,引物特异性主要受3'端序列影响,错配在5'端,影响较小。
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问
如何针对致泻性大肠ETEC的stp和sth基因设计特异性强且有效的引物和Taqman探针?能够使Ct值小一点,荧光强度值大一点
Miracle星
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2、引物GC含量一般为40%-60%, 45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近,一般Tm值不超过5℃。3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间,最好为72℃左右。4、引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修
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问
跑qPCR,内参基因和目的基因CT值正常,结果也比较理想,但内参基因熔解曲线呈较宽的单峰,Tm比目的基因熔解曲线低很多,有效吗?
bamboopiggy
看图,感觉两个melt curve 底边是一样宽的,但是你如果觉得内参基因的宽,可以考虑换一个大家常用的内参基因试试,一般情况,内参基因不会出现这种问题。
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问
qRT-PCR模板稀释比例一般为多少啊?
cq2019
我都是按照1:5的比例来稀释,跑出来的结果非常好
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问
如何判断pcr仪器的样本加热模块是否被污染啊?
bamboopiggy
从你做出的结果分析,如果有个孔漂的太厉害,要么是热盖的问题,要么就是孔被污染了
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问
求问qPCR的引物如何设计,一般选择哪段序列,探针法和燃料法有什么区别?
Eason老歌迷
我们聊一聊探针法和染料法的区别。通过探针可以增加反应的特异性,只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号,能够预测和提前进行反应条件的优化,它的缺点是要合成探针,成本比较高。染料法呢比较经济,可以做溶解曲线,分析全部PCR产物的M值,缺点就是特异性没有探针法高。
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问
定量Pcr时候怎么减少加样导致的误差
cq2019
为了尽量减少由于加样导致的误差,可以把混合液加完后,最后再加cDNA,加的时候枪头不要深入液体面,同时每加一个孔都要换枪头,最后2000r/min离心
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问
PCR结果中,二聚体太亮怎么办
bamboopiggy
你这除了二聚体,看不到条带啊,你可以试试降低引物的浓度,但是是感觉你引物之间的结合影响了你引物和模板的结合
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