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科研学霸天团，48小时有问必答

问为什么荧光定量 PCR 的扩增产物长度不能太长？

tao0129

你说的这种Real-time PCR应该是通过Taqman探针检测的。Taqman探针为基础的Real-time PCR以引物和探针序列决定反应的特异性，而通过荧光强度判断探针降解程度，从而推断模板量。

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问PCR 有条带，但是转化后再验证却出现假阳性？

我是金博士

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。　　引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但

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问PCR 时变性时间 15s 退火时间 15s 是否会对结果产生影响？

丁香通官方号

引物与PCR大小无关，基本上引物在20-30 bp。

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问扩增产物滞留在加样孔中了怎么办？

tao0129

1. 有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。2. 另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

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问PCR 产物电泳为什么都在 marker 最高的条带之上？

tao0129

这表示你的扩增不成功。解决方法：1. 是调整PCR体系的条件啦，看看你的试剂、试验参数有没有问题。2. 如果确信自己的PCR技术没问题的话，换一种引物试试看。如果另一种引物能够扩出来，那就是你的引物有问题啦！

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问PCR 产物是否可以直接连到相应的载体上？

tao0129

1克隆产物应该用载体两端含有的引物进行鉴定。2. PCR产物是否可以直接连接到相应载体，要看你PCR用的什么酶。3.用Taq酶的产物末端自动加A，为黏性末端，可以直接连接；如果是用高保真酶，产物是平末端，必须进行磷酸化或者末端加A才能连接。

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问扩增产物居然有很长的拖尾现象？

tao0129

使用Taqman探针做荧光定量PCR的产物一般都会做的很小，100 bp 多点吧，最大也不超过200 bp 的，你用的退火温度是50度，非特异扩增是不可避免的，即使引物的特异性很好，引物二聚体也肯定存在，而且大小和产物接近，所以在电泳的时候出现脱尾现象很正常。为什么扩增曲线会很好呢？因为使用了Taqman探针，只有特异性扩增产物会产生荧光，把引物二聚体和非特异扩增都屏蔽了，所以扩增曲线会很好！另外

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问PCR 扩增产物如何保存？最多可以保存多久呢？

tao0129

放在-20度应该可以保存一段时间。即使放4度也可以放一段时间。酶切产物也可以放一段时间，如果只是跑胶的话，如果第一次跑的不理想，可以再跑一次。但如果做分子生物学实验，另说。

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问扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅？

tao0129

1.最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系.2. 与反应起始时RNA的总量及纯度有关。3. 建议在试验中加入对照RNA。4.第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10。5. 建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ

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问PCR 扩增产物浓度不够

赵栋2012

对于克隆所需，你可以多扩增几管，然后合并回收/浓缩。提高产物量建议：1. 如果你没有引物二聚体，建议你提高引物浓度试试。2.尽量降低退火温度。3. 鉴定用的话可以增加循环数，克隆的话就没必要了（<35)，循环数增加突变几率也会增加的。4. 如果你觉得模板浓度太高，可以降低浓度的，太高不好，引物正确配对的机会降低。5. 鉴定用可以考虑重新设计引物的，扩增产物长度不必太长200bp左右就行了。6

1 回答2656 围观

问假如模板DNA中混有杂蛋白是不是就扩增不出来

我是金博士

你的DNA模版是怎么提取的呢？有没有进行过处理？扩增没成功，有很原因，杂蛋白的影响也要看情况，一般试剂盒都能去掉的。

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问PCR后没有目的核酸条带？

小坏2012

1.看看你用的引物适不适合做cDNA的扩增，不要用扩增DNA的引物扩增cDNA。2. 拿到cDNA后做扩增之前，最好做一个阳性对照，看看你的扩增体系工作如何。3. 当然非常少见了，如果你的扩增体系工作的，就是说你的试剂都work的，那么就要考虑你的仪器是不是工作的，有时候PCR仪永久了不维修会有这种情况发生。

1 回答783 围观

问为什么要使用基因特异性引物？

tao0129

GSP在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物用于mRNA片段的逆转录。

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问阴性对照或空白对照翘尾

tao0129

原因：1. 模板提取环境有污染。2. 模板提取操作有污染。3 试剂配制过程存在污染。

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问DNA 纯度的判断根据 OD260/OD280 的比值判断，在什么范围是最佳？

小坏2012

符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6~1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得，你可以自己算一下OD260/OD280，如果在要求的范围内，说明你的OD320偏高，即可能有有机物污染，比如酒精未充分挥发。纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋

1 回答773 围观

问我的菌落 PCR 一直做不出来，一直没有找到原因，希望大神帮忙给点思路~

我是金博士

这里的问题很多：1、连接后有没有跑过条带，是不是已经连上了？2、如果连接产物，跑电泳有条带，再转化后没有条带，说明转化有问题，培养时间多长？Amp抗性筛选，容易出现卫星菌落，严格控制时间在12-16h，尽量多挑几个菌落PCR。3、诱导不出，是很正常的，需要摸索最佳诱导条件，可以参考文献报道的诱导条件，然后摸索。比如改进诱导剂浓度，温度梯度，诱导时间等。

1 回答4424 围观

问通过 PCR 扩增出来的目的基因有粘性末端或平末端吗？

tao0129

常规Taq酶PCR产物3‘端带A，为粘性末端。高保真酶如PFU之类的PCR产物为平端。详见你使用的Taq酶说明。

1 回答1207 围观

问PCR 扩增产物于引物区会发生移码突变吗？

tao0129

一般来说测序在最开始的20个碱基是不太会有好的峰型的，但是如果你几次测序都是这个结果，那么就应该是引物合成的问题了。一般生工默认的合成引物会有三种纯化方式，PAGE胶纯化，过柱子和HPLC，三种的价格是PAGE另外，你的酶切位点与突变的位点不在一个位置，所以由于酶切造成的可能性不是很大，但也不能排除这个原因。

1 回答2544 围观

问PCR产物用来跑电泳跑不出条带

我是金博士

要么胶有问题，可以同时做个参照，要么PCR不稳定，也很正常的，P不出来就要重新设计引物了哦

1 回答1350 围观

问PCR最低反应体系

我是金博士

你为啥要5μl体系呢？理论是引物和模版按比例啊，这样不太好操作呀，不符合常规呢。

1 回答1091 围观

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