如何针对致泻性大肠ETEC的stp和sth基因设计特异性强且有效的引物和Taqman探针？能够使Ct值小一点，荧光强度值大一点
李艳_dxhs
采用国标所给的基因序列找到ETEC的整个stp和sth基因，然后用primer express3.0.1手动设计引物和Taqman探针，序列大小118~122。在合成之后用takara的试剂进行qPCR扩增，发现20ng/微升浓度DNA扩增的stp和sth基因Ct值很大（大于28），比lt基因大了10个Ct值。用此引物做普通PCR电泳看有条带但没有国标中的引物扩增的亮。王芳妹的文献中有扩增曲线还行但单独拿引物PCR电泳结果无目标条带。把这两个st基因在DNAMAN中看二级结构，发现很多二级结构。序列比对发现这两个基因同源碱基也较多，怎么设计区分这两个基因的引物探针并且提高扩增效率？
2 个回答
Miracle星
1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过5℃。
3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为72℃左右。
4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰，且 3’端的碱基一般不用A；引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。
6、尽量在基因的编码区（CDS序列）上设计引物，限制基因组DNA扩增。
7、使用BLAST检索，确认引物特异性。
Eason老歌迷
引物设计，有一个原则就是最好不要有二级结构。你可以查查文献看看。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是，在哪条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。
