【心得】关于提高PCR反应特异性的一点经验和思考

众所周知,PCR技术以其高敏感性在分子生物学上得到了广泛应用,然而每一种方法再其优势方面的同时,其不可避免存在相关的问题,比如PCR技术的高敏感性是不是与其高特异性是一对矛盾??
本人就个人研究过程中的经验总结几点所得,希望能为大家起到抛砖引玉的作用.

首先,先提出影响PCR特异性的几个方面和解决方法:
<font>1. 引物序列</font>
不用多说,引物与模板的匹配是PCR成功扩增的关键,尤其上下游引物3'端的序列一定是要匹配的,但究竟要几个碱基匹配,这个很难确定.另外,上下游引物的Tm值差别不要太大,一般5度以内为适合.
<font>2. 模板浓度和纯度</font>
高浓度的模板除了影响PCR特异性外,其难免存在抑制Taq酶活性的成分,例如蛋白,酚,肝素等物质,因此解决的方法是用提取试剂合提取模板DNA或RNA提高其纯度;对模板进行一定倍数的稀释来减轻其抑制物对Taq酶的影响.
<font>3. dNTP</font>
高浓度的 dNTP也不利于PCR的特异性扩增,有些人在扩增2kb和100bp的目的片段时加的dNTP浓度却是一样,这显然是不科学的.
<font>4. Mg++</font>
Mg++是Taq酶发挥聚合活性必需的,一般Buffer中都含有Mg++,但在有些实验如:荧光定量PCR时需要另外优化Mg++的浓度,因为低浓度的Mg++无法使Taq酶发挥活性,而高浓度的Mg++同样也能使Taq酶的保真性下降和引物结合特异性降低.
<font>5.反应的循环数:</font>
经典PCR反应循环为30个以内,因此高循环数提高了PCR产物的浓度以外,也不可避免的产生了非特异条带.
<font>6. 退火的温度和时间</font>
退火的温度自然是引物特异性的关键要素,但引物合成回来后,单子注明的Tm值并不直接是引物退火应用的问题,其主要原因是合成厂家对引物Tm值的计算方法不同,所以新合成引物进行PCR时最好要做一个退火温度剃度试验.而退火的时间与引物长度有着直接的关系,但一般不是过长的引物退火时间在1min之内时足够的.退火时间过长也会产生引物与模板的非特异结合.
<font>7. 引物的浓度</font>
一对好的PCR引物,在扩增时可能其浓度不会影响其产物的特异性,但如果引物的特异性不高，自然在PCR反应时引物浓度也是需要优化的,而一般PCR反应体系中引物浓度其实都是过量的.
总之,影响PCR的特异性的因素是多方面的,引物是关键,其它参数也是不能忽视的.但如果仅是为了应用PCR来克隆某一目的片段,以上内容可能用处甚微,但如果要通过PCR来建立一种高敏感的诊断检测方法,个人认为以上方面还是可以参考的.希望和大家共同讨论学习!