🔥 PCR 反应体系与反应条件

标准的 PCR 反应体系：

10× 扩增缓冲液 10 μl

4 种 dNTP 混合物各 200 μmol/L

引物各 10～100 pmol

模板 DNA 0.1～2 μg

Taq DNA 聚合酶 2.5 μg

Mg²⁺ 1.5 mmol

加双或三蒸水至 100 μl

PCR 反应条件的选择

PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。

温度与时间的设置：基于 PCR 原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。

1、在标准反应中采用三温度点法，双链 DNA 在 90～95 ℃ 变性，再迅速冷却至 40～60 ℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至 70～75 ℃，在 Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

2、对于较短靶基因（长度为 100～300 bp 时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用 94 ℃ 变性，65 ℃ 左右退火与延伸（此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催化活性）。

① 变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下，93 ℃～94 ℃ 1 min 足以使模板 DNA 变性，若低于 93 ℃ 则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性，就会导致 PCR 失败。

② 退火（复性）温度与时间：退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至 40 ℃～60 ℃，可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸，G + C 含量约 50% 的引物，55 ℃ 为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

Tm 值（解链温度）= 4（G + C）＋ 2（A + T）

复性温度 = Tm 值 -（5～10 ℃）

在 Tm 值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 30～60 s，足以使引物与模板之间完全结合。

③ 延伸温度与时间：Taq DNA 聚合酶的生物学活性：

70～80 ℃ 150 核苷酸/ S /酶分子

70 ℃ 60 核苷酸/ S /酶分子

55 ℃ 24 核苷酸/ S /酶分子

高于 90 ℃ 时，DNA 合成几乎不能进行。

PCR 反应的延伸温度一般选择在 70～75 ℃ 之间，常用温度为 72 ℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般 1 Kb 以内的 DNA 片段，延伸时间 1 min 是足够的。3～4 kb 的靶序列需 3～4 min；扩增 10 Kb 需延伸至 15 min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。

对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定 PCR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓度。一般的循环次数选在 30～40 次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。