PCR 实验基础原理

聚合酶链反应（Polymerase chain reaction, PCR）是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法。双链 DNA 分子在临近沸点的温度下加热时分离成两条单链 DNA 分子（变性过程），一对引物分别和两条 DNA 分子特异位置结合（退火过程），在适宜温度下，DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷酸为原料，产生出新的 DNA 分子（延伸过程

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参加 PCR 反应的物质主要有五种，即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+。引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。

高保真Taq酶下游应用为基因筛选、测序、突变检测，分子诊断等等的用户，往往对PCR保真性要求很高，保真性的一个通用标准是错配率，错配率越低保真性越好。普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数，而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级，大大降低了出错的可能。其原理主要是因为高保真Taq酶具有3‘到5’核酸外切酶（Proofreading）的活性，扩增途中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉

3、延伸温度和时间：引物延伸温度一般为72℃，延伸的时间决定于扩增模板的长度，小于1kb的片段一般1～2min，而10kb的片段可能需要15min或更长时间。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性,亦会影响其产量。4、循环数：在25～30个循环内，扩增DNA增加明显，需要进一步增加产量时，可将第一次PCR产物稀释后再扩增，而不要盲目增加循环数，以免增加非特异扩增。

1．常规程序将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段

一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究