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PCR 实验基础原理

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问pcr的原理是什么呀有可以详细讲解一下的嘛

汤姆卜丽波

在存在DNA模板、引物、dNTPs、适当缓冲液 (Mg2+) 的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的核酸片段进行扩增，这种扩增是以模板DNA与引物之间的变性、退火、延伸三步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。

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问请问巢氏PCR与普通PCR相比有哪些优点？

府宅

巢式PCR操作简单，所需条件与常规PCR相同，但与常规PCR相比进一步提高了反应的特异性与灵敏性，在微生物学、生物信息学、生物医学等方面有着极其广泛的应用。例如巢式PCR技术与RFLP（限制性片段长度多态性）技术结合，通过设计高度保守序列的引物对待检物种DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行RFLP分析，从而完成DNA分子水平上的多态性检测，该法常用于流行病学的调查和临床常规检测。

3 回答952 围观

问pcr中，实验目的对模板dna有倾向吗

unquiet

是实验目的需要什么样的片段，片段的获取决定需要的模板

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问pcr的时候目的基因比内参表达还高的原因是什么

小葡萄1

1.如果同管扩增，引物之间是否有竞争存在2.操作加样时是否有失误3.还有循环次数因素4.一次的现象不能下这样的结论，建议再重复几次。

4 回答972 围观

问实时荧光定量PCR仪中的多通道指什么，有什么用？每个通道怎么都有颜色标记？

土井挞克树

针对每一种荧光的检测器，比如你在一个管中做多个颜色，针对多个靶基因。每个颜色需要一个检测器来检测荧光信号的强弱，每一个针对不同颜色的检测器，就是一个通道

3 回答966 围观

问TaqMan 探针荧光定量 PCR 的原理是什么？

dxywode

在Taqman探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针的5’端标记有报告基团（Reporter，R），如FAM、VIC等，3’端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q），如TAMRA等。当探针完整时，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器不能检测信号。随着PCR反应的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3’→5’外切核酸酶活性被探针切断，报告基团远离淬灭

3 回答1830 围观

问qPCR实验中Ct值是什么意思？有什么作用？怎么看？

天一湖医者

阈值循环数 Threshold cycle (Ct) 也写作Cq值，荧光信号大于荧光阈值时PCR循环数。仪器软件通常将第3-15个循环的荧光值设为基线（baseline），是由于测量的偶然误差引起的。阈值（threshold）一般是基线的标准偏差的10倍。在实际操作中也可以手动调节。高于阈值的荧光信号被认为是真实的信号，用于定义Ct值。Ct会受到阈值的影响，每次试验由于样品和仪器的不同会导致基线不

3 回答1671 围观

问请问qpcr和pcr本质的区别是什么？怎样诊断呢？

迟C迟

qPCR是荧光定量PCR，相比普通PCR，会加入染料，便于收集荧光信号。结果可以得出相对/绝对浓度等多组数据，然后根据你的目的，对实际数据进行分析。还能通过ntc的ct值判断实验合不合格。一般需要单独的仪器，像Roche 480。

3 回答862 围观

问巢式PCR是利用PCR的产物又进行了一次PCR吗？巢式PCR的产物在跑胶时样品不进胶是怎么回事，试过调Ph值，但是不管用

汤姆卜丽波

可能不是ph的问题，有可能是pcr产物蛋白污染了，所以在孔洞里不进胶

3 回答440 围观

问做荧光定量PCR和半定量PCR有什么区别？半定量的PCR退火温度和荧光定量PCR是一样的吗？

迟C迟

荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的，但二者检测的东西多少有些不同。荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料（SYBR green）或者和目的DNA片段结合的荧光探针（taqman)，通过监控PCR过程中的荧光的变化，并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量。荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时

3 回答5056 围观

问PCR引物的设计原则是什么？

赵栋2012

1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。2. 引物长度一般在15~30碱基之间。3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。4. 引物3′端要避开密码子的第3位。5. 引物3′端不能选择A，最好选择T。6. 碱基要随机分布。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。8. 引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。9. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。10

1 回答1449 围观

问同一批MIX，同一条件，同一批PCR，同一块胶，同一电泳，为什么差别就这么大呢

wisdyadong

胶配的不均匀！

8 回答3179 围观

问PCR 实验中 dNTP 加过量会有什么影响？

我是金博士

dNTP可以与Mg2+结合，从而降低体系中Mg2+浓度，造成Taq的聚合活性下降。另一方面， dNTP过量，可以增大错误扩增的几率，导致出现非特异扩增产物和smear。

1 回答3074 围观

问PCR 扩增产物浓度不够

赵栋2012

对于克隆所需，你可以多扩增几管，然后合并回收/浓缩。提高产物量建议：1. 如果你没有引物二聚体，建议你提高引物浓度试试。2.尽量降低退火温度。3. 鉴定用的话可以增加循环数，克隆的话就没必要了（<35)，循环数增加突变几率也会增加的。4. 如果你觉得模板浓度太高，可以降低浓度的，太高不好，引物正确配对的机会降低。5. 鉴定用可以考虑重新设计引物的，扩增产物长度不必太长200bp左右就行了。6

1 回答3851 围观

问用软件进行PCR引物设计时，怎么确保产物长度，怎么设计可以让引物在目的基因起始端

zj佐罗

直接在基因起始点选定引物，设定产物长度。

3 回答707 围观

问引物合成引物有两个Tm值，如何确定PCR的退火温度？

zcldf001

以第一对引物为例：主要的问题是上游引物有稳定的loop，需要提高退火温度，引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率，这样就需要同时增加引物的量。摸索退火温度是要参考Tm，不确定各个公司引物合成单上的计算方法，你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的：0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度，因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。用o

1 回答1016 围观

问前引物和后引物温度Tm相差10℃这对引物还可以用吗

极客医生

当然不用啊说明GC比例不和谐啊

1 回答2524 围观

问PCR引物设计及内参

天一湖医者

引物设计用动物基因好就可以内参也可以用动物源设计

3 回答1120 围观

问临床组织标本冻存已久（半年以上），还能做PCR吗？

天一湖医者

基本上不可能成功了。mRNA都降解完了。要做RT-PCR应该尽量选择新鲜的组织材料，即使保存，也要-80°，而且时间不要太长，最多几天吧。

3 回答1112 围观

问PCR最低反应体系

我是金博士

你为啥要5μl体系呢？理论是引物和模版按比例啊，这样不太好操作呀，不符合常规呢。

1 回答1425 围观

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