用软件进行PCR引物设计时，怎么确保产物长度，怎么设计可以让引物在目的基因起始端

直接在基因起始点选定引物，设定产物长度。

软件设计的时候，可以选择产物的长度，你把产物长度控制好，就可以让引物在基因的起始端

引物设计应注意如下要点：

1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应[2]。

2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。

3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。

4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。

5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearest

neighbormethod)[6][7]。

6.?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G值相对较高的引物。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。

7.引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。

8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC2含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。