引物设计时，GC含量过低提高不上去怎么办

你可以考虑酶切位点以及保护碱基里面多加几个GC就好啊。

一般GC含量低的话把引物序列设计稍微长一点,就可以补偿Tm低的问题.你说的百分比差别也不是那么大.如果两个引物的tm不同,按照低的考虑PCR的退火温度.加酶切位点的引物的Tm需要按照不包含酶切位点的序列计算.GC含量最好在50%以上比较好,不然退火温度达不到,建议重新设计引物,试试梯度PCR的策略.

可以在后面加一小段高GC的序列不影响特异性识别和结合

引物足够长时，即使GC含量稍微有点低也没有关系