丁香实验_LOGO
登录
提问
提问
我要登录
|免费注册
收藏
wx-share
分享

长片段PCR实验

实验分类:

PCR 技术

别名:

long PCR,long and accurate PCR,long range PCR

最新修订时间:

简介

常规 PCR 反应可以扩增到 3〜4 kb 的 DNA 片段,而超过 5 kb 的 DNA 片段就已经很难扩增出来了。虽然有人可以扩增出 5〜15 kb 的 DNA 片段,但产量很低。造成常规 PCR 扩增长片段 DNA 效果不好的原因有以下几点:

① 常规 PCR 反应中应用的耐热 DNA 聚合酶(如酶)缺乏 3'→5' 核酸外切酶活性,不具备很好的校读功能,因而具有较高频率的错误碱基的掺入,不能有效扩增长片段 DNA;

② 较长的模板 DNA 容易形成高级结构,使 DNA 聚合酶难以与模板结合,也就实现不了其聚合功能;

③ 较长的模板 DNA 变性存在困难;

④ 缓冲液在 PCR 高温条件下可能会失去缓冲能力,造成模板 DNA 和产物 DNA 的损坏;

⑤ 二价阳离子在高温条件下也会促进 DNA 的降解。要想较好地扩增出长片段 DNA,必须解决上述 5 个问题。其中最为关键的是第 一个问题,其它问题可以通过调整反应条件给予解决。第一个问题的解决需要利用一种具有及时 切除错配碱基的酶。自然界中存在这样的酶,例如 Pfu、Vent、Deep Vent 等,它们具有 核酸外切酶活性,具有校读功能,但链延伸能力较弱,单独使用此酶也不能完成长片段 DNA 的扩增,需要和常规 PCR 中的 DNA 聚合酶联合使用。

1994 年,Barnes 等[1] 首次将两种 DNA 聚合酶联合起来成功地扩增出 35 kb 的 DNA 片段。不久,Cheng 等[2] 用相似的方法以 RDNA 为模板扩增出 42 kb 的片段和以人基因组 DNA 为模板扩增出 22 kb 的片段。由此也就真正形成了一套长片段 PCR(long PCR、long range PCR 或 long and accurate PCR)的技术方法。

原理

长片段 PCR 实验的基本原理是用两种 DNA 聚合酶进行反应,一种是用常规 PCR 反应中应用的耐热 DNA 聚 合酶(常用 Taq 酶),它具有很强的延伸能力,依赖此酶进行链的延伸。另一种是具有 3'→5'核酸外切酶活性的耐热 DNA 聚合酶(常用 Pfu 酶),它具有较好的校读功能,可以将错配的碱基切割下来重新利用第一种酶进行链的延伸。两种酶各有优缺点,充分利用第一种酶的延伸能力和第二种酶的校读功能,使两种酶在反应中相辅相成,完成长片段 DNA 的扩增。

应用

长片段 PCR 实验的常用应用领域如下:

(一)长片段 DNA 的克隆

由于真核生物的基因存在内含子和外显子,一般基因较长。常规 PCR 技术很难扩增全长, 而长片段 PCR 为扩增这样的基因提供了技术平台。由于能够扩增大到 20〜50 kb 的片段,将使从 cDNA 中分离完整的基因简便易行,从而不必费时地从基因组文库中筛选目的基因。有人用长片 段 PCR 克隆到了全长的 HLA-B 基因,同时获得了 HLA-B 的新的等位基因。Benkd 等人式将长 片段 PCR 和反向 PCR 融合在一起,结合杂交技术,成功地扩增到了包含鸡内生原病毒元件的长 片段 DNA。另外,用长片段 PCR 可以从未克隆的 mRNA 延伸产物的混合物中产生大的 cDNA 分子。大的基因组片段可以从复杂的基因组杂交细胞系和显微解剖或流式细胞仪分离的染色体区 段中得到。

通过对感染性克隆的反向遗传学操作,实现了对 RNA 病毒的基因操作,在深入阐明病毒基 因组结构与功能、构建新型病毒载体以及筛选疫苗候选株等方面有很好的应用前景。传统构建克 隆的方法涉及许多亚基因组片段的克隆与连接,非常繁琐费时,长片段 PCR 技术的发展使得一 次性获得病毒的基因组序列成为可能,因而大大简化了全长 cDNA 克隆的构建过程。为了了解来 源于病人不同组织的 HIV-1 突变体病毒在定向性运动和增殖动力学方面的差异,Dittmar 等[们用 长片段 PCR 从一个 HIV 患者外周血单核细胞、淋巴结、脾、脑和肺中扩增出 HIV 的全长 DNA, 并在其 5’端加了此种病人特异的长末端重复,从而构建成了具有繁殖能力的 HIV 病毒。通过对 这些重组病毒定向性运动(包括定向于外周血单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞)和增殖能力的 实验,发现这些重组病毒具有相似的定向性运动和增殖活力,淋巴结来源的重组病毒和非淋巴结 来源的重组病毒在定向性运动中没有差别。应用此技术已经成功构建了 SFV (cpz)、TBE、甲型 肝炎、柯萨奇病毒 B6 和 JE 等 RNA 病毒的全长 cDNA 克隆。另外,以 PCR 为基础的染色体步行 技术也因长片段 PCR 的出现得以更广泛地应用。

(二)基因组研究

在基因组多样性研究中,起关键作用的是染色体上多态标记的复合体 —— 单模标本。这种标 记对于绘制疾病相关基因以及分析基因敲除小鼠非常有用。有人用等位基因特异的长片段 PCR 扩增到了 CD4 的单模标本,发现两个分子标记是分开的:一个是双等位的 Alu 缺失,另一个是 多等位性的重复。

对扩增片段进行限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析,是常用的基因检测方法,长片段 PCR 技术的发展增加了 RFLP 的应用范围及准确度,已应用于检测 mRNA 分子的突变、基因作图等研究。扩增 50 kb 的靶序列将给分析细菌人工染色体(BAC)克隆和 P1 来源的人工染色体(PAC)克隆以及小的酵母人工染色体带来很大的方便。Skiadas 等人建立了一种光学 PCR 技术,此技术是将长片段 PCR 和光学基因组作图结合起来而建成的。它可以对细菌人工染色体和大的基因组 DNA 分子进行限制性酶切图谱分析,从而对序列未知的基因组位点进行基因组作图。此技术的优点是快速、不需要克隆载体,会得到高 质量的物理图谱。

另外,长片段 PCR 技术可以用于微生物分型、基因型及准种分析等多个研究领域。炭疽芽胞类杆菌的基因组序列是极其保守的,很难用常规的方法检测到不同菌株之间的 DNA 差异。近来有人用长片段 PCR 方法建立了一种可以简单高效地检测不同菌株之间差异的方法。针对炭疽芽胞类杆菌 DNA 序列中的重复元件设计单一引物,可以扩增到 10 kb 左右的多个 DNA 片段。通过对多种菌株扩增这样的片段,就可比较出不同菌株中存在的片段多少和片段大小的差异,从而可以区分不同的菌株,并可确定不同的菌株的特征。

随着多种基因组序列的测序完成,长片段 PCR 将会更加发挥其优势,在功能基因组时代占据一定的位置。例如,长片段 PCR 分析一个群体中的大分子的限制性片段长度多态性;通过扩增包含不同数目和长度内含子的基因组 DNA 片段,可以弄清楚内含子/外显子的边界;分离位于已知序列旁边的未知序列,产生一系列大小不同的扩增产物,以方便填补物理图谱中未克隆的 DNA 间隙,获得紧密相连基因之间的次序和方向;扩增散布重复序列之间(或不同类重复单位之间)的 DNA 区域,有利于 DNA 片段的指纹分析以及毗连 DNA 片段的排序和定向;应用于定 向转座子介导的作图和测序,这是一种潜在的快速高效分析 100 kb 甚至更大片段的有力手段等。

(三)基因突变和基因表达的检测

长片段 PCR 技术在检测基因突变和基因缺失方面有十分广泛的应用。TSC2 基因的大片段突 变是造成常染色体显性遗传病结节性硬化症(TSC)的原因之一。对 TS 以 基因大片段基因突变 的常规检测方法是 Southern 杂交和原位荧光杂交,但这些方法具有需要 DNA 量大等缺点。用长 片段 PCR 只需要较少量的基因组 DNA,并且很容易证实突变位点的序列。Dabora 等人⑼用长片 段 PCR 检测到 6 个 TSC 病人中存在着不同的 DNA 缺失,缺失片段大小分别为 4.5 kb、39 kb、 34 kb、1.4 kb、1.3 kb 和 lO.l kb。这一方法的应用为 TSC 的诊断提供了更多的理论依据。在另一 常染色体遗传病一多囊肾中,PKDI 基因的突变可能是其发病的原因之一口。入当用长片段 PCR 扩增 24 个病人样品的 PKD1 基因时,发现了 7 种突变,其中有两个缺失(一个缺失 3 kb, 一个缺失 28 bp), 一个单碱基插入突变和 4 个核昔酸替代。因此,长片段 PCR 技术为探测长序列 复杂基因的突变提供了可能,从而为检测致病基因的突变和缺失带来了方便。另外,有人已经用 长片段 PCR 技术将病毒基因组和线粒体基因组扩增出来,以便寻找基因突变和基因缺失。

在检测基因重排和基因融合方面,长片段 PCR 可扩增含有可扩展的三联体重复序列的基因如 亨廷顿(Huntington)病基因,为亨廷顿式病进行症状前诊断成为可能。Friedreich 共济失调症病人的 FRDA 基因内含子的扩增产物显示,GAA 三联体扩展很可能与发病相关。并且,用长片段 PCR 技术研究表明,肌强直性营养不良病与亨廷顿病和 Friedreich 共济失调症有相似的发病模式。长片段 PCR 用来探测染色体转位位点的基因重排对临床诊断血液性恶性肿瘤非常有帮助。在 mRNA 水平对这些疾病的诊断通常要依赖于 RT-PCR 和 Northern 分析;在 DNA 水平,由于基因重排造成的基因跨度远远超过了传统 PCR 的扩增范围,用长片段 PCR 可以解决这个问题。近来有人口用长片段 PCR 技术建立了一套基于基因组 PCR 的探测系统,成功证实了 5 号染色体的 NPM 基因与 2 号 染色体 ALK 基因的融合,融合后的基因会产生一种不可思议的转录体(NPM 的 N 端序列与 ALK C 端序列的融合转录体)。用长片段 PCR 对 11 个肿瘤样品中两个基因融合位点的 DNA 扩增发现, NPM 和 ALK 基因融合的位点是唯一的,并且在两个染色体上有相同的内含子参与其同源重组过 程。也有人在 B 细胞肿瘤中检测到了在染色体转位处有多种基因融合。

另外,在检测特异表达基因方面,将 RT-PCR 和长片段 PCR 结合起来,可以扩大对稀有转录体和组织特异表达基因的检测范围。有人用此技术扩增到了 13。 5 kb 的差异 cDNA0 在基因打靶研究中,寻找到一种简单高效的筛选阳性克隆的方法是至关重要的。Lay 等人切用长片段 PCR 成功地建立了这样一种方法。首先从基因组文库中用长片段 PCR 扩增出目标基因及其两侧特异的序列,用此序列设计引物,再次用长片段 PCR 检测中靶情况。他们对缩胆囊素和胃泌激素基因打靶的胚胎干(ES)细胞的实验表明,此方法对于快速准确地鉴定胚胎干细胞中等位基因位点的同源重组情况是非常有用的。

来源:丁香实验团队

操作方法

长片段 PCR 实验

常规 PCR 反应可以扩增到 3~4 kb 的 DNA 片段,而超过 5 kb 的 DNA 片段就已经很难扩增出来了。虽然有人可以扩增出 5~15 kb 的 DNA 片段,但产量很低。造成常规 PCR 扩增长片段 DNA 效果不好的原因有以下几点:① 常规 PCR 反应中应用的耐热 DNA 聚合酶(如酶)缺乏 3'→5' 核酸外切酶活性,不具备很好的校读功能,因而具有较高频率的错误碱基的掺入,不能

提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
关注公众号
反馈
TOP
打开小程序