长片段PCR技术心得分享

PCR技术自1983Mullis发明以来，给生命科学带来了历史性的变化，现已成为分子遗传学、基因组测序和作图、法医学、系统动物学等各领域内不可缺少的工具。但是，普通的PCR最长只能扩展2-3kb左右的短片段基因，对于5kb以上的长片段基因很难有效的扩增，这使PCR受到了很大限制。故人们一直以来都在尝试利用PCR扩展出更长片段的PCR。

“LongPCR”这个名词和技术最早由美国华盛顿大学医学院的Barnes WM提出。其设想来自于他1992年一次实验错误。最初他想用常规PCR方法扩增来自Bacillus thuringiensis(Bt，苏云金杆菌)的一种2kb的蛋白质基因。在实验过程中使用的引物末端出现了差错,模板链上是A的位点，其对应的引物位点也是A，这一位点不匹配导致了PCR扩增反应终止,未得到预期产物。Barnes用的聚合酶是Klentaq1，是TaqDNA聚合酶N端缺失突变体，无外切酶和内切酶活性。为解决模板--引物不匹配问题,他试着用另一种聚合酶Pfu来代替Klentaq1，此酶具3→5外切酶功能，但结果还是没有得到预期产物。Barnes设想Pfu可能过多地切掉了引物末端的核苷酸，就将Klentaq1和少量的Pfu结合使用,竟然成功了。Barnes解释其原因是“Pfu需要切除不匹配的核苷酸，使Klentaq 1继续扩增”。Barnes进一步设想，如果引物与模板不匹配能导致PCR终止，那么聚合酶延伸过程中产生的不匹配是否也会对扩增反应产生同样的终止作用呢？如果是的话，那么这就是限制PCR产物长度的主要因素。正是基于这种思路，Barnes确立了用双聚合酶系统来扩增长目标序列,即无外切酶功能的DNA聚合酶(主导酶，majorpolymerase)和具3→5校对功能的DNA聚合酶(校对酶，minorpolymerase) 的组合，最后得到了长达28kb的产物。由此人们开始打开长片段PCR的大门，最终科学家发展出了一种新PCR技术———长PCR(longPCR)，用于扩增大于5kb的DNA片段。至今为止，长PCR技术已成功地用于扩增人类β球蛋白基因簇22kb的DNA片段、噬菌体基因组42kb的片段和人类线粒体基因组16.3kb的片段。

我是从13年开始尝试扩增长片段的，在经过一些摸索，并不断的改变PCR条件，终于扩增出8.5kb长的人类基因组DNA。经过这两年的时间，我整理了一些限制长片段PCR的因素及一些解决方法：

1. DNA模板的质量问题
a. 模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。这个情况下应该使用较为新鲜的样本以及较为温和的提取方法来降低DNA模板因在提取过程中损伤情况。
b. 模板里面残留某种试剂成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是这种情况，可以用试剂盒把模板再纯化一下，或将模板做个梯度稀释以确定最佳的模板量。

2. DNA聚合酶的影响
a. Taq酶具有较高的错误率，导致产物3’端出现错配碱基，DNA合成提前结束。这时应该使用一些错配率更低的耐热聚合酶，如klentaq、pfu、rTth、Vent等。从不同文献中可以得到使用双酶系统更有利于长片段DNA的合成。
b. Taq酶在PCR的过程中活力下降，会增加非特异扩增以及二聚体的出现。这时应该使用缓冲能力较强的缓冲液，使缓冲液的pH值不会降得过低而影响酶活性；也可在PCR体系中添加一些促进剂，以降低退火温度或/和提高聚合酶的稳定性，从而促进长片段扩增的进行；也可稍微降低变性温度，以保证聚合酶的活性。

3. 在PCR过程中损伤了DNA模板，使其断裂或脱嘌呤，导致长片段PCR无法进行。这时我们可稍微降低变性温度或/和在PCR体系中添加一些促进剂，以降低退火温度，从而减少DNA模板的损伤。

4. 引物问题
a. 样品自身的基因型差异导致扩增失败。也就是说你的引物与某些基因型的样品结合的好，而和另一些基因型结合不好。可以设计一对更保守的引物试试。
b. 引物设计的不好，会导致二聚体出现、非特异性扩增或无法扩增。长片段PCR的引物设计原则和普通PCR一样，只是较长一些（21-34个核苷酸），以便提高退火温度，从而提高反应的特异性。但也不要太长，以免引物间互补形成二聚体。

5. 模板的结构复杂度
对于模板结构复杂，如GC含量高（>60%），有二级结构等，普通的长片段PCR可能难以延伸下去，加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行，但DMSO有毒，而且用量需要优化。

6. 非特异性扩增或扩不出条带，这时可以通过调整PCR体系或调整PCR程序来减少非特异性。
根据这些经验和资料，我首先对双酶系统进行确定，我先后用过许多公司不同的酶组合，最后我选择了北京佳兰生物的klentaq酶和pfu酶进行组合，klentaq与pfu酶的比例是20:1。

接着，我先挑出一个能扩增3.6kb的10×buffer（参考分子克隆实验指南（第三版）中长片段PCR，上册668页），然后再用这10×buffer来扩增8.5kb。当然，8.5kb不是那么好扩的，一开始并未扩出目的基因，在经过调整一些组分后，主要是增加了镁离子和dNTPS的浓度，我将镁离子浓度增加到4.5mM，dNTPS增加到750µM each。终于扩出了8.5kb长片段基因，虽然还有很多非特异性扩增。下面来看看我的实验实例：

首先是模板，我要确保DNA模板的完整以及纯度，我用的是全血DNA试剂盒（simgen）来提取人类基因组DNA，并将DNA测OD及跑电泳。其次是引物，我用的是资料中常用的Human β-globin gene 8.5kb引物，由英潍捷基合成。

引物：Forward TGATAGGCACTGACTCTCTGTCCCTTGGGCTGTTT
Reverse ACATGATTAGCAAAAGGGCCTAGCTTGGACTCAGA
条件：