ISSR－PCR 技术

ISSR－PCR 技术，英文名是 inter－simple sequence repeats－PCR，是在 SSR 的基础上发展起来的一种新型的分子标记，是于 1994 年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。它的生物学基础仍然是基因组中存在的 SSR。ISSR 标记根据植物广泛存在 SSR 的特点，利用在植物基因组中常出现的 SSR 本身设计引物，无需预先克隆和测序。用于 ISSR－PCR 扩增的引物通常为 16~18 个碱基序列，由 1~4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，从而保证了引物与基因组 DNA 中 SSR 的 5' 或 3' 末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段被 PCR 扩增。SSR 在真核生物中的分布是非常普遍的，并且进化变异速度非常快，因而锚定引物的 ISSR－PCR 可以检测基因组许多位点的差异。

ISSR－PCR 技术的基本原理：

ISSR 是一种以 PCR 技术为基础的分子标记，由 Zietkiewicz E 等于 1994 年首次提出⑵，其基 本原理就是在 SSR 的 3' 或 5' 端加锚 1~4 个嗦吟或嚅嚏碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列 SSR 之间的一段 DNA 序列进行扩增（见图 11－2）， 而不是扩增 SSR 本身，然后进行电泳、 染色，根据谱带的有无及相对位置，来分析不同样品间 ISSR 标记的多态性。它在引物设计上比 SSR 技术简单得多，不需知道 DNA 序列，即可用引物进行扩增。SSR 技术的原理和操作与 SSR、RAPD 非常相似，但其产物多态性远比 RFLP、SSR、RAPD 更加丰富，可以提供更多的 关于基因组的信息；由于其退火温度相对来说较高（252 °C）， 试验重复性也更好。

ISSR－PCR 技术可用于遗传作图与基因定位，亲缘关系和遗传多样性的研究，分子标记辅助育种。

器材：PCR 扩增仪

试剂：

① 模板：基因组 DNA

② dNTP 混合液：每种脱氧核糖核苷酸的浓度为 2.5 mmol/L

③ 引物：浓度为 10 umol/L

④ Taq DNA 聚合酶

⑤ 10× PCR 缓冲液

⑥ 高压灭菌去离子水

⑦ 用于琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳的试剂

ISSR－PCR 技术的基本过程可分为如下几步：

（一）流程一

引物设计：引物设计是 ISSR 技术中最关键、最重要的一步。

基因组中的 SSR 一般为 2~6 个寡聚核苷酸，用于 ISSR 的引物常为 5' 或 3' 端加锚的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数（n）一般为 4~8 次，使引物的总长度达到 20 bp 左右。5' 或 3' 端用于锚定的碱基数目一般为 1~4 个，锚定的目的是引起特定位点退火，使引物与相匹配 SSR 的一端结合，而不是中间，从而对基因组中特定片段进行扩增、检测。

基因组中，发现最多的 SSR 是二核苷酸重复序列，如（AT）n、（TA）n、（CA）n 等，因此，ISSR 技术中所用的引物以加锚的二核苷酸重复序列为主，寡聚三核苷酸、四核苷酸用得比较少。一般来说，ISSR 引物为通用引物，不像 SSR 引物那样需要根据物种基因特征合成引物。大多数引物是在 3' 端加锚，加锚的位置直接影响到扩增结果。

通常研究者使用一种引物，但也有研究者应用一对不同的引物，如（CA）n＋（AC）n、（TG）n＋（GT）n 等，这些引物不仅能扩增出单引物所产生的全部带纹，而且常有新的 DNA 片段被扩增出来。

（二）流程二

模板：

一般使用经过试剂盒提取的基因组 DNA。

（三）流程三

设立 50 ul 的 PCR 反应体系：

在 0.25 ml 的 PCR 管中，分别加入：

如果 PCR 仪没有热盖，在反应液上加一滴矿物油（约 50 ul）。将 PCR 试管放入到 PCR 仪中。

（四）流程四

设置 PCR 反应条件：

PCR 反应中的温度要根据具体反应而定，一般来说每分钟合成 1000 bp 左右。

需要做预实验，对变性温度、复性温度、热循环程序进行优化，以获得清晰、可重复、易统计的带纹。

（五）流程五

PCR 产物的检测和分析：

PCR 产物需经电泳分离、染色显示后才能进行谱带观察、统计。目前 DNA 分离中所用的电泳介质都可用于 ISSR 扩增产物的分离，琼脂糖浓度常用 1.5％~2.0％，聚丙烯酰胺常用浓度为 6％，后者的分离效果通常会更好。用硝酸银或溴化乙锭 （EB） 染色后，在可见光 （银染） 或紫外光 （EB 染色） 下进行观察，统计带纹的有或无及相对位置，然后根据研究目的，应用相关软件进行分析。

① 要保证 DNA 模板的质量，DNA 模板的质量及数量直接影响到 PCR 效果。

② 不同引物的退火温度应根据引物的 Tm 值要略有变动。ISSR 引物的长度一般都在 15~24 bp，反应的退火温度 52~55 °C，比 RAPD 的 36~40 °C 高，ISSR－PCR 反应的敏感性低于 RAPD；ISSR 引物含有一定长度的重复序列，与它结合的目标序列在 DNA 复制的过程中存在滑动和不均等交换现象，使得它们在不同品种或个体间的重复次数存在较大差异，更易于导致引物 结合位点和两结合位点间的片段长度产生差异。

③ ISSR－PCR 扩增的带型背景较强时，可在 PCR 反应体系中增加一些化学物质，使背景颜色减弱，条带清晰。在 ISSR 反应体系中加入 2％ 甲酰胺能够降低由于引物滑动而引起的背景模糊，加入 2％~4％ DMSO 能提高反应的特异性。