RAPD和ISSR技术

DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组 DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆 后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。
在真核生物基因组中均存在着由1～4个碱基对组成的简单重复序列（Simple Sequence Repeats）简称SSR,又称之为微卫星(Microsatellite),如(GA)n、(AC)n、(GAA)n等。同一类微卫星DNA可分布在整个基因组不同位置上,由于其重复次数不同或重复程度不完全而形成每个座位的多态性。SSR两端有一段保守的DNA序列,通过这段序列可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引物,对SSR进行PCR扩增,由于SSR多态性仅由简单序列的重复次数的差异引起的,通常表现为共显性。SSR扩增产物通常采用高浓度的琼脂糖胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。ISSR(Inter-Simple Sequence Repeats)是一种新型的分子标记,是于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。它的生物学基础仍然是基因组中存在的SSR。ISSR标记根据植物广泛存在SSR的特点,利用在植物基因组 中常出现的SSR本身设计引物,无需预先克隆 和测序。用于ISSR-PCR扩增的引物通常为16～18个碱基序列,由1～4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合,导致位于反向排列,间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。SSR在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR可以检测基因组 许多位点的差异。有时为了增加多态性,常常采用一个SSR序列和一个随机引物组成的引物对,这样就又获得了另一种与SSR相关的标记,这种标记一端可以锚定在SSR序列中,另一端则可以通过随机引物来筛选,同一个SSR序列引物与不同的随机引物组合,可以获得各种各样的组合,从而得到更多的多态性。

RAPD
一、 材料       不同来源的DNA(50ng/ul)。
二、设备
　　PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。
三、试剂
　　1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。
    2、Taq酶(5U/ul)：购买成品。
　　3、10xPCR 缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris•Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％ Triton X-100。
　　4、MgCl2 ：25mmol/L。
　　5、dNTP(1mmol/L)：每种2.5mmol/L。
    6、undefinedTBE buffer
注意：枪头和Epp管要灭菌
四、操作前准备
1.dNTP工作液处理：
dATP（100Mm）+ dGTP（100Mm）+ dTTP（100Mm）+ dCTP（100Mm）各取出10ul混合，再从中取出4ul＋96ulH2O ，配成1mM
dNTP过夜冻融会降解，各取4种dNTP各10ul混合后作为储液
   2.DNA模板的处理：
DNA不能反复冻融，取DNA提取液5ul与H20 45ul混合，即将模板稀释10倍，大约20ng/ul
   3.引物（0.2OD）
室温平衡2min，离心机最高速度离心2min，加入400ul H20，充分溶解，成为5Um
   4.Taq酶处理
Taq母液5u/ul稀释5倍成为1u/ul
   5.Maker处理
1ul（50ug）Maker＋1ul Loading buffer＋4ul ddH20
   6.5×TBE buffer（5L）
     27g Tris－base＋13.75g硼酸＋10ml 0.5mol/l EDTA(PH8.0) ＋ddH2O
五、操作步骤：
1. 在25ul反应体系中,加入(1tube)(可以混合多管后分装)
　　　　模板DNA（5Um） 4ul (50ng)
　　　　随机引物(5Um) 2ul (约5pmol)
　　　　10xPCR Buffer(undefined) 2.5ul
　　　　MgCl2 (25Mm) 2.5ul
　　　　dNTP(1Mm) 2.5ul
　　　　Taq酶 1单位（U） 0.2ul
　　　　加ddH2O 至 25ul   ()为原浓度
　　混匀稍离心, 加一滴矿物油。
　　2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 2分钟，共40轮循环。
　　3. 循环结束后, 72℃ 7分钟，4℃保存。
　　4. 取PCR产物20ul加4ul上样缓冲液 (6x)（1：5）于1.4% 琼脂糖胶上电泳（可以不换枪头，于缓冲液中冲洗），高压200V 2min使样品离孔，稳压60Ｖ2h（电压低带型整齐， 分辨率高）（小板）。
5. Maker 4ul
6. 电泳结束，观察、拍照。
　　[注意] 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。
　　　　　　2、 特异性的DNA带可以克隆 作为一个新的分子标记应用。
ISSR
反应体系：10xPCR Buffer 2ul
          模板DNA(5Um) 4ul (50ng)
　　　　  引物(5Um) 2ul (约5pmol) 
　　　　  MgCl2 (25Mm) 2.5ul
　　　　  dNTP(1Mm) 2.5ul
　　　　  Taq酶 1单位（U） 0.2ul
　　　　加ddH2O 至 20ul  
ISSR-PCR设置： 94℃变性5min后，94℃变性30sec,52℃退火45sec，72℃延伸2min,共45个循环，然后72℃延伸7min,最后将结果置于4℃冰箱中。扩增产物在用5×TBE配制的2.0%的琼脂糖凝胶中电泳分离