RAPD分析技术

1.  扩增偏差或无扩增。

（1）在部分或全部管中缺少一个组分。重复少量几个反应以确定所有的PCR组分是否都已加入。

（2）PCR抑制物可能与DNA一起纯化，改变DNA的浓度。

（3）在DNA分离中加入一个清洗步骤（如苯酚抽提）。

（4）稀释新的DNA溶液。

（5）引物母液失效。重新配制母液，使用不同的引物或提高引物浓度。

（6）延长退火时间（在PCR程序中的第二部分），或降低升温转换步骤之间的速率。

（7）提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。

（8）补加新的组分，该灭菌的都高压灭菌。

2.  扩增结果差，条带模糊或难以辨认。

（1）更换Taq聚合酶缓冲液。

（2）检查引物（使用另外一个引物，或者将引物末端标记，在16% 6 mol/L尿素聚丙烯酰胺胶上电泳检测）。

（3）检查Taq聚合酶活性（与不同批量的酶作比较）。

（4）改变DNA浓度。

3.  高相对分子质量产物弥散状分布>4 kb。

（1）降低DNA浓度。

（2）降低Taq聚合酶浓度。

（3）减少凝胶上样量。

（4）可能是由于循环数过多的结果（Bell和Demarini 1991），减少循环数。

（5）确认是否使用正确的缓冲液（不是水！）制备凝胶。

（6）在较低的电压下电泳。

4.  对照和所有检测样品中均为一条很强的单一带。

确认引物序列不是回文结构。这可能是引物多聚体造成的结果。使用不同的引物。

5.  带谱不可重复。

DNA过多或过少。把基因组DNA浓度控制在10～100 ng范围之内，DNA量太少时，“真正”靶序列与引物的结合效率低，因此引物扩增会产生假的条带，这就称为引物伪迹；DNA量太多会导致错误配对（指引物与基因组DNA的配对）。每个样品进行两个不同DNA浓度的反应。只考虑主要条带。

6.  染色后凝胶背景太强影响分辨率。

（1）减少染色时间。

（2）凝胶脱色时间延长。

（3）PCR反应中DNA含量或Taq聚合酶过多。

7.  低相对分子质量产物分离不充分。

在更高浓度的琼脂糖凝胶、专业纯凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。