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引物合成引物有两个Tm值,如何确定PCR的退火温度?

相关实验:PCR 引物设计及评价实验

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xlzhao

新手最近PCR。引物是参考BLOOD合成,引物合成有两个Tm值,如64.07度(0.05M Na+);73.08度(1M Na+),如何据此确定退火温度?另外,我的上游引物GC含量达71%(因为觉得BLOOD是权威杂志,之前未认真计算),不知有没有PCR成功的可能性?出了神马问题?敬请高手指点。(5个基因光退火温度摸了快两个月,还没结果,着急啊) 有木有,有木有!!!!???
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1 个回答

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zcldf001

有帮助
以第一对引物为例: 主要的问题是上游引物有稳定的loop,需要提高退火温度,引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率,这样就需要同时增加引物的量。 摸索退火温度是要参考Tm,不确定各个公司引物合成单上的计算方法,你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的:0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度,因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。 用oligo分析会给出3种Tm,大多数情况下可以参考Td,这个方法考虑了3末端碱基。 因此,建议在65-72度范围内做梯度,引物浓度各0.4uM
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