引物合成引物有两个Tm值，如何确定PCR的退火温度？

xlzhao

2021-11-16

新手最近PCR。引物是参考BLOOD合成，引物合成有两个Tm值，如64.07度（0.05M Na+）；73.08度（1M Na+），如何据此确定退火温度？另外，我的上游引物GC含量达71%（因为觉得BLOOD是权威杂志，之前未认真计算），不知有没有PCR成功的可能性？出了神马问题？敬请高手指点。（5个基因光退火温度摸了快两个月，还没结果，着急啊）有木有，有木有！！！！？？？

1 个回答

zcldf001

2021-11-16

有帮助

以第一对引物为例：主要的问题是上游引物有稳定的loop，需要提高退火温度，引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率，这样就需要同时增加引物的量。摸索退火温度是要参考Tm，不确定各个公司引物合成单上的计算方法，你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的：0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度，因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。用oligo分析会给出3种Tm，大多数情况下可以参考Td，这个方法考虑了3末端碱基。因此，建议在65-72度范围内做梯度，引物浓度各0.4uM