根据引物合成单如何设定PCR退火温度?
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问题:引物 单上数据如下
上游TTACAAGATGGAGCCTCACC(GC含量50%)
Tm(1M Na+):68.2
Tm(50mM Na+):46.6
下游CAAAGAATAACCCAGGACGA(GC含量45%)
Tm(1M Na+):66.2
Tm(50mM Na+):44.6
顺便问下大家,Tm(1M Na+)和Tm(50mM Na+)有什么区别啊?
回答:
TM值是在一定buffer盐浓度情况下计算出来的。你需要查一下你的PCR体系里buffer盐的浓度,然后找相应的TM值。不过TM值也是一个估算值,举个例子,以你的正向引物而说,TTACAAGATGGAGCCTCACC。在primer5计算得到TM是54.0, DNA STAR是49.1.所以这个数值仅供参考,最稳妥的做法是用梯度PCR仪从55-65做一个梯度PCR。
PCR 能不能做出来最关键的因素有两个,第一,模板质量如何,第二,引物3'是否有错配,gc含量如何。如果错配不严重的话,采用无脑梯度pcr的方法总能找到一个合适的退火温度。