PCR程序设定是根据什么来的？

pcr程序设定取决于：1.扩增酶的类型，决定变性温度，扩增效率等；2.扩增引物，决定退火温度；3.目的片段大小，决定延伸时间。

你买的QP试剂盒上的程序设定时间和温度就行啊。

• 1．常规程序

• 将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。在每一个循环中，先于94℃保持30秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度（一般50-60℃之间），一般保持30秒钟，使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟（扩增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环。重复这样的循环25～35次，使扩增的DNA片段大量累积。最后，在72℃保持3-7min，使产物延伸完整，4℃保存。

• 2．复性（退火）和延伸温度

• 复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。

• 3．反应时间

• 变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。

• 4．循环次数

• 循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。

• 平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。

• 5．PCR反应液的配制

• PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样，在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。

• 对于使用具3’-5’外切活性的高温DNA聚合酶时，有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时，如果将反应成分分开配制，A管含模板、引物和dNTP，以及调整体积的H2O，B管含缓冲液、DNA聚合酶和水，然后再将两管溶液混合起来，可较好地克服。

PCR程序设定依据：

95度：保证DNA双链解开的温度
50-55度退火：保证引物结合模板的温度
72度延伸：结合引物后聚合酶利用游离碱基补齐双链的温度相对的30秒、45秒、2分钟是各自阶段需要的时间循环数：每次循环，DNA数翻倍，最终获得足够多的片段。

技术关键：

1，控制污染，千万别污染，做好阴性和阳性对照。
个人见解，最重要的：模板质量；
2。好的模板是成功pcr的基础；
4，包括酶的选择、退火温度和时间、合适的pcr方法，以及随后的实验的重要原因；
3，实验条件，几乎与上个因素同样重要的是：引物设计。其序列、长短和酶切位点的添加，是pcr的效率和特异性，按其重要性排列

PCR程序设定是根据酶的说明书和你引物的tm值来确定，关键在于annealing temperture的设定和extension time的设定。