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PCR 反应体系与反应条件、Taq 酶的选择、循环参数的设定

相关实验:逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR,rtpcr)

别名:PCR 实验,PCR 扩增,PCR 条件

最新修订时间:

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合作专家 | 徐颖博士

结构生物学 中国科学技术大学

原理

聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法。

双链 DNA 分子在临近沸点的温度下加热时分离成两条单链 DNA 分子(变性过程),一对引物分别和两条 DNA 分子特异位置结合(退火过程),在适宜温度下,DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板,利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷酸为原料,产生出新的 DNA 分子(延伸过程)。

变性-退火-延伸就是一个 PCR 循环,新产生的 DNA 分子同时能作为下一次反应的模板,使得产物以 2n 增长,以微量的模板获得大量的目的基因。

用途

分子克隆、cas9 小鼠的检测

材料与仪器

仪器:

① 移液枪

② 离心机

③ PCR 仪

试剂:

① 模板 DNA

② 引物

③ 商品化的 DNA 聚合酶

④ 无菌双蒸水

⑤ dNTPs

耗材:

① 微量枪头

② PCR 管

步骤

1、从 -20 ℃ 冰箱取出商品化的 DNA 聚合酶、缓冲 buffer、dNTPs、模板 DNA、引物和无菌双蒸水,置于冰上解冻。

2、在冰浴中,按以下次序分布将各成分加入 PCR 管中。

PCR 体系:

组成成分

体积(uL)

ddH2O

to 50

2 × Phanta Max buffer

25

dNTP Mix(10 mM each)

1

引物 F(10 uM)

2

引物 R(10 uM)

2

模板

50 ng

Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase

1

3、设定反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置于 PCR 仪中,开始扩增。

一般在 93-95 ℃ 预变性 3~5 min,而后进入循环扩增阶段:94 ℃ 30 s → 55 ℃ 30 s → 72 ℃ 60 s,循环 30~35 次,最后在 72 ℃ 扩增 5~10 min。

PCR 程序:

温度(℃)

时间

循环数

95

3~5 min

1

95

15 s

35

55

15 s

35

72

2 min

35

72

5~10 min

1

16

Forever

 

4、结束反应,PCR 产物置于 4 ℃ 冰箱待电泳检测或 -20 ℃ 长期保存。

注意事项

1、反应体系与反应条件的选择现在市面上的商品化的 DNA 聚合酶有多种,里面也配备了相应的 Buffer,包含各种所需的催化离子与缓冲液的成分,实验时只需要按照说明书加以稀释并配制反应体系即可,有时也可以同等比例放大或缩小,需要说明的是同等比例的放大或缩小并不意味着实验产物同等比例的缩放。

2、酶的选择

早期的 PCR 扩增是由大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段完成的,但是这种酶不耐热,每一个循环之后都需要加入新的酶。从嗜热水生菌 (Thermus aquaticus)中提取的 Taq DNA 聚合酶在较高温度下依然保留活性,避免了繁琐的操作,简便了 PCR 的步骤。现今,各个公司对酶的称呼不一,很多经过 Taq 酶改造而来,也有其它来源的 DNA 聚合酶,建议综合考虑保真性、扩增速度、操作简便性、价格等衡量因素选择合适的 DNA 聚合酶。此外,过高的温度以及过长的时间对 DNA 聚合酶的活性都有影响。

3、变性温度不能过高,会影响酶的活性,变性温度低,解链不完全,导致引物不能结合,得不到扩增产物;

4、退火温度与引物的 Tm 值有关,退火温度一般设置为 Tm-5;

5、循环参数的设定依据实验目的而定,一般的检测质粒构建是否成功,20~24 个循环就可以;而对于构建过程获得 PCR 产物来说一般 28~34 个循环左右。循环数太小,获得的产物不够,循环数太多浪费时间,产物的特异性也不一定好,不是循环数越多越好。

6、依据实验目的调整反应体系,使得 PCR 过程经济、高效。

常见问题

一、扩增产物突变

1. 有可能是模板突变;

2. 切胶回收过程中,紫外线的照射导致;

3. 扩增过程中酶的保真性不好,建议更换新的产品。

二、扩增产物产量低

1. 与引物的特异性有关,重新设计引物;

2. 简单的扩大体系不能增加产量。

来源:丁香实验

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