反转录 RT-PCR 实验流程

一、总 RNA 的提取
见总 RNA 的提取相关内容。

二、cDNA 第一链的合成

目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1.在 0.5ml 微量离心管中，加入总 RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H₂O 使总体积达 11μl。在管中加 10 uM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心；

2.70℃ 加热 10 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min；

3.取 0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2μl；上游引物（10 pmol/μl） 2μl；下游引物（10 pmol/μl） 2μl；dNTP (2mM) 4μl；10x PCR buffer 5μl；Taq 酶（2 u/μl） 1μl。轻轻混匀，离心。42℃ 孵育 2-5 min；

4.加入 SuperscriptⅡ 1μl，在 42℃ 水浴中孵育 50 min；

5.于 70℃ 加热 15 min 以终止反应；

6.将管插入冰中，加入 RNase H 1μl ，37℃ 孵育 20 min，降解残留的 RNA。-20℃ 保存备用。

三、PCR

1.取 0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2μl；上游引物（10 pmol/μl）2μl；下游引物（10 pmol/μl）2μl；dNTP (2 mM) 4μl；10x PCR buffer 5μl；Taq 酶（2 u/μl）1μl；

2.加入适量的 ddH₂O，使总体积达 50μl。轻轻混匀，离心；

3.设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照；

4.电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

5.密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

1.获取目的基因的 DNA 分子片段；

2.检测目的基因表达情况；

3.重组表达载体的构建。

组织、细胞 RNA 提取试剂、RNase 抑制剂、dNTP 混合物、TaqDNA 聚合酶、第一链 cDNA 合成试剂盒、离心管、离心机、水浴锅、PCR 热循环仪、PCR 管、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶图像分析系统、移液管、移液枪、离心管盒、正向引物和反向引物、琼脂糖；

一、总 RNA 的提取
见总 RNA 的提取相关内容。

二、cDNA 第一链的合成

目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

1.在 0.5ml 微量离心管中，加入总 RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H₂O 使总体积达 11μl。在管中加 10 uM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心；

2.70℃ 加热 10 min，立即将微量离心管插入冰浴中至少 1 min；

3.取 0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2μl；上游引物（10 pmol/μl） 2μl；下游引物（10 pmol/μl） 2μl；dNTP (2mM) 4μl；10x PCR buffer 5μl；Taq 酶（2 u/μl） 1μl。轻轻混匀，离心。42℃ 孵育 2-5 min；

4.加入 SuperscriptⅡ 1μl，在 42℃ 水浴中孵育 50 min；

5.于 70℃ 加热 15 min 以终止反应；

6.将管插入冰中，加入 RNase H 1μl ，37℃ 孵育 20 min，降解残留的 RNA。-20℃ 保存备用。

三、PCR

1.取 0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2μl；上游引物（10 pmol/μl）2μl；下游引物（10 pmol/μl）2μl；dNTP (2 mM) 4μl；10x PCR buffer 5μl；Taq 酶（2 u/μl）1μl；

2.加入适量的 ddH₂O，使总体积达 50μl。轻轻混匀，离心；

3.设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在 PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如 G3PD）的特异性引物，同时扩增内参 DNA，作为对照；

4.电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；

5.密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

1.在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；

2.为检测提取的 RNA 中是否有 DNA 污染要设置阴性对照；

3.内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；

4. PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；

5.防止 DNA 的污染：采用 DNA 酶处理 RNA；在可能的情况下，将 PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和 mRNA 的共线性。

1.反转录酶的选择

（1） Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相对较弱，最适作用温度为 37℃；

（2）禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA 酶 H 活性。最适作用温度为 42℃；

（3）Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在 Mn2+ 存在下，允许高温反转录 RNA，以消除 RNA 模板的二级结构；

（4）MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体：商品名为 Superscript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA 转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长 cDNA。

2.合成 cDNA 引物的选择

（1）随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96% 来源于 rRNA。

（2） Oligo (dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3' 端 Poly (A+) 尾，此引物与其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly (A+) RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。

（3）特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA 3' 端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。