反转录 RT-PCR 实验进阶

一材料与设备 1)poly(A)+RNA,lmg/ml Z)oligo(dT)12-18,lmg/ml 3)lmol/LTris-Cl（pH7.6)。 4)1mol/LTris-Cl(pH8.3) 5)lmol/LKC1 6)25 mmol/LMgCl2 7)dNTP 混合物，各 5 mmol/L 8)0.lmol/LDTT 9)RNasin。 10) 反转录酶，鼠源反转酶 (

一、材料 1. 缓冲液、溶液和试剂 去除 RNA 酶的双蒸水 10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKCl,15 mmol/LMgCl2) 2. 酶和酶缓冲液 MMLV 逆转录酶（100-200U/ul) SUPERaseINRNA 酶抑制剂（20U/ul;Ambion) Taq DNA 聚合酶（5U/ul) 3. 核酸和

反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量的 RNA 样品分析成为可能。

一、总 RNA 的提取见总 RNA 的提取相关内容。二、cDNA 第一链的合成目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。1.在 0.5ml 微量离心管中，加入总 RNA 1-

酶促催化使RNA反 转 录 为cDNA第一链。 一 条寡聚脱氧核苷酸引物先 与 mRNA杂交，然 后 由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步 用 于PCR扩增。依据实验的不同目的，针对单链cDNA第一链合成的引物 可根据特殊的靶基因设计特殊的引物与之杂交，或可用随机引物与所有mRNA杂交等。

反转录 PCR 测定 IFN-γ 细胞因子方法是利用 RT PCR 技术检测 IFN-γ 细胞因子的一种方法。

反转录巢式 PCR(RT－nested PCR)是在反转录 PCR 的基础上发展起来的，在通过反转录获得 cDNA 的基础上，对目的基因进行巢式 PCR 扩增。它和简单的反转录 PCR －样是用于检测某种 RNA 是否被表达，或者比较其相对表达水平，但是特异性更高、可靠性更强。

PCR是从转录水平上检测目的基因,而非蛋白，从转录到翻译还有复杂的过程，因此基因的表达量与蛋白的表达量不一定是正相关的。WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白，这点ELISA做不到，ELISA可用定量方法检测蛋白,也就是说你可以观察不同浓度刺激物对目的蛋白的影响。基因翻译蛋白质，PCR可以检测基因的表达量，绝对定量和相对定量。但基因翻译表达蛋白质是个复杂的过程，有可能出现基因量大而蛋白质少，或者相

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。

荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。利用荧光染料与被研究对象（

几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P. Peng等人设计合成三中