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反转录 RT-PCR 实验进阶

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问提取RNA做逆转录，然后用逆转录的c DNA做荧光定量PCR。结果发现没有扩增成功，一直在0上下波动，是什么原因呢？

灵枢天问

是不是你的SYBR出了问题，失效了或者提出来的RNA降解了

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问关于随机引物反转录的一些问题

Eason老歌迷

你想纯化，但是发现没有过滤掉短的，是这样吗？我有一个方法，可以试一试。1. 20μLPCR产物加入5 μL 5M的NaCl（终浓度0.5 M）。2. 加入25 μL 24%的PEG8000溶液（终浓度12%）；混匀。3. 4度放置30 min。4. 4500 g，4℃离心30 min 后，立即将板反扣在厚的吸水纸上，离心至150 g，去除上清。5. 加入70 μL 75%EtOH，4500 g，4

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问逆转录添加RNA时，所有样本的RNA的量要相同吗？

balalaLy

要，一般用500-1000ng的RNA。

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问rna的二级结构对全长rna反转录有何影响？怎样排除影响因素？

dxy_gwrp7ndq

AMV在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍

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问提出来的Rna浓度只有200ng/ul,略有降解，反转录出来的cDna作为模板，然后去跑pcr,是不是跑出来的条带都很浅呀

Eason老歌迷

有点浅。引物、模板没问题的话,就加cycle,多扩几轮,就亮了.（一般pcr酶和buffer是没有问题的,除非你反复冻融或者长时间放置室温）如果上一轮扩出来特异性好的话,可以适当降低退火温度.多扩了几轮,退火温度也降低了,但是条带仍然很淡,这时候,基本上就是引物和模板的问题了.你要好好看看引物特异性好不好,dimer亮不亮,（自身发夹一般不会有太大影响）；模板的话,要看看GC含量高不高,模板质量好

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问进行RT-PCR需要将样本RNA浓度调成一致再进行接下来的实验吗？

Eason老歌迷

最好是把浓度统一一下。RT-PCR的目的是看目的基因在不同样品中的表达量。因此，比较的前体必须是所有样品的总RNA量必须相同或接近相同，通常的做法是用内参基因的表达近似得来反应总RNA的量。

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问反转录实验之前如何分析RNA样品符合实验要求？逆转录完成的DNA怎么知道满足做qPCR模板的要求？

迟C迟

1）检测RNA溶液的吸光度280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核酸

4 回答499 围观

问反转录pcr试剂盒中随机引物合成片段的原理是什么，大小会不会不一样

bamboopiggy

随机引物：某些特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列，比较难以转录成全长序列时，可采用非特异的随机引物来转录全长mRNA。选择这种引物，体系中所有RNA分子会全部充当DNA第一链模板，然后PCR引物在下游扩增过程中再扩增特异的目的基因。通常，用此引物合成的cDNA中，96%来源于rRNA。Oligo(dT)：绝大多数真核细胞的mRNA具有3’端Poly(A+)尾，所以使用Oligo(dT)仅mR

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问小鼠肾脏中采用RT-PCR，WB测NO相关指标结果与血浆NO浓度趋势不一致，该如何分析？

loveliufudan

这个情况有几种可能的解释：这个NOmRNA可能不是编码eNOS蛋白的mRNA，而是其他的与NO有关的mRNA。因此，你需要仔细检查你所测定的mRNA是哪一个。尽管NO蛋白和mRNA在生物学上都与NO的生物学功能相关，但它们的关系可能非常复杂。例如，NO的生物合成和降解是高度调节的，可能存在不同的机制来调节NO的生成和释放，以及调节eNOS的表达和稳定性。因此，这两个结果可能只是巧合。由于你使用了模

3 回答430 围观

问RT-PCR实验内参问题

illusio

可能第一遍的时候RNA降解严重，或者逆转录失败

3 回答468 围观

问RT-PCR的相关问题？

bamboopiggy

只合成第一链就可以做RT-PCR，随着扩增过程，会形成第二链的。

3 回答382 围观

问反转录同样按试剂盒建议量加，之后由SYBR染料法改为taqman探针法，结果曲线非常乱，不具有特异性，怎么改进

bamboopiggy

跟反转录和sybr的关系不大，可能是你taqman探针法的引物有问题

4 回答401 围观

问反转录失败，p不出条带，求指教！

曙光karry

1. cdna 梯度稀释3-4个浓度 2换一个反转录的盒子做一下

4 回答618 围观

问QPCR逆转录问题咨询

bamboopiggy

你可以再补点成20ul体系，加1000ng不就可以了。你加多了rna，可能会影响酶的逆转效率的。

3 回答525 围观

问RT过程以相同效率反转录rna，是什么意思？怎么实际操作呢？

天一湖医者

RT过程应以相同效率反转录RNA，否则会影响qPCR的启动效率，进而带来不同的实验结果，因此对于每个RT反应应使用相同的条件。如果你需要对同一样本的多个目标进行分析时，可选择两步RT-PCR。另外，当RNA的存储是个问题时,最好是进行两步RT-PCR，因为cDNA在-20℃是稳定的。

4 回答439 围观

问在做cas9的反转录扩增，使用哪种反转录酶，更容易扩增出来？有没有做过的朋友

天一湖医者

所选试剂在扩增过程中应产生较高且一致的cDNA得率，以获得具有高灵敏度和低变异性的基因表达结果。可考虑预混液形式的逆转录酶用以可以减少实验误差。

3 回答381 围观

问模版非常低，反转录时，扩增长片段5K左右，使用oligo dT，还是特异性引物，更容易扩增出来？

未来9

一般情况简单地说你的目的mRNA有playA尾，且基因较小2000bp以内吧都可以选择oligo dT；基因特异性引物适用于与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况.。

3 回答435 围观

问反转录时，对于长片段，使用oligodT好呢，还是特异性引物好呢？

天一湖医者

一般情况简单地说你的目的mRNA有playA尾，且基因较小2000bp以内吧都可以选择oligo dT；但如果你的目的mRNA没有playA尾或者你的基因较大时，由于RT酶的扩增能力问题就要用随机引物。

3 回答558 围观

问同一批样本,两次反转录成的cdna，为什么rt-pcr差异那么大？是反转录试剂新旧的问题吗？

bamboopiggy

1.你两次反转录时间间隔多久？时间长了，本身rna就会有降解。2.你反转录的效率每次和每次也是略有差异的，

3 回答1151 围观

问弱弱的问一句，所以文献中经常看到的qRT-PCR就是Real-time RT-PCR（RT-qPCR）吗？

whilt-shirt

是的，qRT-PCR就是Real-time RT-PCR

4 回答6596 围观

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