RT过程以相同效率反转录rna，是什么意思？怎么实际操作呢？

根据反转录试剂盒说明书，对所有样品添加一模一样的反转录反应体系，尤其是体积要特别注意一样，还要尽量同时加进去，再同时在pcr.仪上加热扩增。就是保证除了样品不同，其他都一模一样。

.实验前的准备

1.1实验器具的准备：RT-PCR所用的500μl和200μl薄壁EP管、移液器吸嘴最好用进口的，因为进口EP管、移液器吸嘴已经去除了RNasin，也已经灭菌处理过，可以直接用。实验前用干净的镊子夹取出EP管、移液器吸嘴插好备用，注意镊子不要碰到EP管内壁和吸嘴的尖部。如果用国产500μl和200μlEP管和移液器吸嘴，则要提前配制0.05%——0.1%的DEPC水，将EP管、移液器吸嘴和吸嘴盒都浸泡在DEPC水中过夜后再用蒸馏水反复冲洗掉粘附的DEPC，再高压灭菌后60℃烤干备用。注意DEPC有毒，在配制及使用时应在通风橱进行，应全程带手套、口罩。

1.2试剂的准备：做RT-PCR的试剂应提前确定储备量，如试剂量不能满足一次完整的RT-PCR操作，应马上订购试剂，等试剂到了以后再做。因为RNA易降解，提取之后就应立即反转录，或在-80℃冰箱中保存，但是反复冻溶也容易使RNA降解，所以一旦RNA提取或溶解就应立即进行反转录。RT-PCR的试剂都应在冰上溶解。

1.3仪器：高速冷冻离心机、PCR仪、核酸检测仪、凝胶成相系统都应提前检查是否处于正常状态。特别是PCR仪对环境温度有要求时，应提前保证环境温度。

1.4RNA浓度测定：RNA提取后必须测浓度，记录A260吸光度及A260/A280的值，计算RNA浓度及纯度。

1.5反应体系的计算：做反转录时，根据RNA浓度计算出RNA样品的量和DEPC水的量。做PCR时，反应体系根据cDNA的样品数计算每种试剂的量，可以多计算一个（吸嘴和管壁上会粘），混后均分。反应体系的计算是非常重要的，如果出错，不但浪费试剂和样品，结果有错误，也耽误时间。

2.实验操作细节

2.1实验操作过程中必须带口罩、手套，实验室尽量避免人员干扰。

2.2RT-PCR的试剂都应在冰上融化，等完全融化后再取；用过的试剂应瞬间离心后放回-20℃保存；试剂应按顺序加，加完后再混匀离心。

2.3加入试剂前在管壁上做好标记，避免加错试剂；加过一种试剂后将EP管盖子的方向改变，避免重复和漏加；不同试剂和样品要更换吸嘴，避免污染；吸取试剂和样品前检查移液器的标数是否正确，核对正确后再取，避免浪费试剂。

2.4反应体系放入PCR仪前应检查荧光定量PCR仪的反应程序或设计新的反应程序，做PCR时循环参数应根据反

RT过程应以相同效率反转录RNA，否则会影响qPCR的启动效率，进而带来不同的实验结果，因此对于每个RT反应应使用相同的条件。如果你需要对同一样本的多个目标进行分析时，可选择两步RT-PCR。另外，当RNA的存储是个问题时,最好是进行两步RT-PCR，因为cDNA在-20℃是稳定的。

因为反转效率不同，产生的cdna产量就不同。可以经mrna稀释到相近的浓度，一起反转，不要有的浓度高，有的浓度低，相差太多，会导致反转效率差异，然后结果不准。