反转录PCR （RT―PCR, Reversed Transcript PCR）

互联网2013-12-26

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1 原理 　　

RT—PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析,还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。

RT-PCR的模板可以为总RNA 或poly(A) 选择性RNA 。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。

在实际应用中，RT—PCR又常常分为一步法RT—PCR和两步法RT—PCR。

2 特点

一步法RT—PCR反应更加快速、灵敏，操作简便，污染率低，RNA 二级结构减少，并且因为聚合酶有校正活性，从而降低了PCR反应的错配率。而在两步法中，反应的精确度高，人为的误差相对较小，并且由于在第一步中将RNA 反转录为cDNA，从而更易于保存。

另外，两步法的整个过程比一步法更节省费用。传统检测方法的样品用量一般在ug级，而在RT—PCR检测系统中样品用量陡降至pg级。这就在很大程度上降低了实验操作的难度，特别是mRNA 样品制备的过程得以简化。

3 应用

对基因转录产物进行定性与定量的检测，相对传统的检测方法，如Northern杂交、斑点杂交（ RNA dot）等而言，RT—PCR的精确度更高，且样品用量显著减少。利用RT—PCR对难检测的基因进行相应的检测与研究更易获得成功。

另外，还能同时分析多个差别基因的转录。在植物方面，RT—PCR常常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。

对基因转录中剪切与拼接的检测：如果RT—PCR引物确定了mRNA 片段，根据其是否包含某个外显子，将产生两种差别DNA片段，进而在凝胶电泳图谱上显示出迁移率不同的条带。因为转座子涉及到特定的DNA序列及转座酶识别位点，用RT—PCR方法可以较精确地研究转座过程的分子机制。