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实时 RT-PCR 实验

最新修订时间:

材料与仪器

RNA 模板 DNA 酶缓冲液 DNA 酶 I DEPC 处理的水 oligo(dT) MgCl2 dNTP EDTA

步骤

—、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

①10ul 消化体系的组分。

RNA 模板(最多 1ug/10ul)                             xul

10XDNA 酶缓冲液                                           1ul

DNA 酶 I,1U/ul(Invitrogen18068-015)           1ul

DEPC 处理的水                                              8~xul

②20ul 反转录体系的组分。

oligo(dT)12~180.5ug/ul                                   0.5ul

Random Hexamer50ng/ul                                 0.5ul

RNA 模板(最多 1ug)                                      xul

10X 缓冲液                                                      2ul

(20 mmol/LTris-HCl、pH8.4,500 mmol/LKCl,25 mmol/LMgCl2)

25 mmol/LMgCl2                                               4ul

10mmol/LdNTP                                                 1ul

0.1mol/L 二硫苏糖酵(DTT)                              2ul

RNA 酶 OUT(40U/u1)1ul

SuuerscriutⅡ(50U/ul) 反转录系统(Invitrogen11904-018)1ul

25 mmol/LEDTA                                                 1ul

DEPC 处理的水                                                  补足到 20ul

二、方法

1.把上述的 10ul 消化体系混匀,25°C(室温)孵育 15 min, 然后加入 25 mmol/LEDTAlul,然后 65°C 孵育 15 min,以使 DNA 酶 I 失活。

2.每次进行 RT-PCR(20ul) 时,PCR 管应放在冰上混合各种成分。逬行多个反应时除了 RNA, 可以把所有的试剂混在一起,然后分装。反应条件:25°C 孵育10min,42°C 保持 30~50 min,70°C 再保持 15 min, 最后在冰上冷却。

3.反转录完成后,最好加入 1ulRNA 酶 H,37°C 孵育 20 min 以消化剩余的 RNA。用上面所述的Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG 反转录得到的 cDNA, 即可用作实时 PCR 的模板,也可于-20°C 保存以备将来之用。

来源:丁香实验

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