RT-PCR 原理与实验技术

一、知识背景

1. 基因表达：DNA——RNA——Protein

单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因——104 个丝心蛋白 mRNA（每个 mRNA 存活 4 d，可以合成 105 个丝心蛋白）——共合成 109 个丝心蛋白 。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。

2. PCR 技术（Polymerase chain reaction）：

即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：

A.变性：通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA；

B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

C.延伸：在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2＋存在下，退火引物沿 5‘ —— 3’ 方向延伸。

以上三步为一个循环，如此反复。

3. 逆转录酶和 RT-PCR

逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，至少具有以下三种活性：

(1)依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性：以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链；

(2) Rnase 水解活性：水解 RNA:DNA 杂合体中的 RNA；

(3)依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性：以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA.

二、RT-PCR的准备

1. 引物的设计及其原则：

(1)引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。

在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:

a.引物长度:一般为 15～30 bp ，引物太短会影响 PCR 的特异性，引物太长 PCR 的最适延伸温度会超过 Taq 酶的最适温度，也影响反应的特异性。

b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现 3 个以上的单一碱基。GC 含量（Tm 值）：40％～60％，PCR 扩增的复性温度一般是较低 Tm 值减去 5～10 度。

c.3‘ 端要求：3’ 端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发效率最低，G、C 居中间，因此引物的 3’ 端最好选用 A、G、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T。

d.引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。

e.引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于 4 个连续碱基互补，3’ 端不应超过 2 个。

f.同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。

g.5’ 端无严格限制：5’ 末端碱基可以游离，但最好是 G 或 C，使 PCR 产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。

根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0，Oligo6.0 等对于这些条件都可以自行设置。

2. 耗材：

3. 试剂准备：

三、RNA 的提取方法

RT－PCR 中从细胞分离的 RNA 的质量至关重要，包括 RNA 的纯度和完整性。RNA 分离的最关键因素是尽量减少 RNA 酶的污染。但 RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性 RNA 酶外，环境中也存在大量 RNA 酶。

因此在提取 RNA 时，应尽量创造一个无 RNA 酶的环境，包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性 RNA 酶，通过 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶。

RT－PCR 步骤：

1、RNA 的提取：

2、cDNA 的合成：

逆转录体系的组成：

3、PCR 扩增：

50ul PCR 体系的组成：

4、PCR 反应条件：

四、PCR 条件的优化

五、产物的电泳和结果的测定

根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度），取适量 PCR 产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm 电泳 45－60min。成像系统成像分析。

分离不同大小 DNA 片段的合适琼脂糖浓度

六、需注意的问题

1. 注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：氯仿、溴化乙锭（EB）、酚、异硫氰酸胍、紫外线等。

2. 注意避免试剂污染。

3. 始终注意避免 RNA 酶的污染。

4. 保管好自己专用的试剂，公用试剂保管好，相互协调，注意实验室卫生。