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怎么 RT-PCR 老不出结果

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zhangcs

各位老师,师兄师姐好!我做小鼠stat1和ICAM-1的半定量RT-PCR,一开始自己设计引物,primer5 评分均为100分,stat-1那对引物第一次P出来了,条带很亮,无杂带,无引物二聚体,但从第二天开始就死活P不出来,ICAM-1还没P出来过,于是重新设计引物,primer5评分仍是很高,仍是死活P不出目的基因。内参倒是次次出现,条带从来都是很亮的。没办法只好用外文提供的引物,仍无结果。于是请同学用他的试剂盒试着P一下第一次P出来过的那对引物,操作也由他来操作,仍是只p出内参,我现在已是黔驴技穷,下一步我该怎么办,怎样找原因?如有哪位老师能提供经验证过的相关引物,不胜感激,谢谢!
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1 个回答

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zhangcs

有帮助
我的目的基因长度是580bp,第一次三管p出来的也是580bp,污染或杂带也不会这么巧就出现在这个位置吧,另外我用的是同一台pcr仪,同试验室的师兄也用这台pcr仪,没问题呀,至于条件,我做过很多次梯度了,循环次数也改了很多次,由于我的目的基因比较长,4500bp,而且产物片断也比较长,我怀疑是不是目的基因断成小片断了,我因此也重提了很多次RNA ,但还是不行呀,我下一步该怎么办,帮帮我吧,谢谢了!
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