－－PCR/RT-PCR疑难问题解答－－

－－PCR/RT-PCR疑难问题解答

1.问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

可能原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；
在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；
如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂会释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。

2）RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法：
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法：
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。

4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议解决方法：
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体，确定GSP是反义序列。

5）起始RNA量不够
建议解决方法：
增加RNA量。
对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

6）RNA模板二级结构太多
建议解决方法：
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火，提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。

7）引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议解决方法：
在PCR前用RNaseH处理。

8）靶序列在分析的组织中不表达
建议解决方法：
尝试其他靶序列或组织

9）PCR没有起作用
建议解决方法：
对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

2.问题：PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。

可能原因：
1）PCR引物设计较差
建议解决方法：
避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。

2）DNA含有抑制剂
建议解决方法：
诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。

3）富含GC的模板
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。

4）模板浓度太低
建议解决方法：
使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。

5）镁离子浓度太低
建议解决方法：
从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。

6）退火温度太高
建议解决方法：
使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。

7）引物浓度太低
建议解决方法：
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。

3.问题：RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。

可能原因：
1）物和模板非特异性退火
建议解决方法：
在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。

2）GSP设计较差
建议解决方法：
遵循用于扩增引物设计的同样原则

3）RNA中沾染了基因组DNA
建议解决方法：
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。

4.问题：PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。

可能原因：
1）形成引物二聚体
建议解决方法：
设计在3'端没有互补序列的引物。

2）引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。

3）镁离子浓度太高
建议解决方法：
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。

4）因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法：
使用巢式PCR或递减PCR。

5）沾染外源DNA
建议解决方法：
使用抗气雾剂的tip和UDG。

6）因为二级结构导致引物结合位点无法接近
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。

5.问题：PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误

可能原因：
1）聚合酶忠实性低
建议解决方法：
使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。

2）循环数太多
建议解决方法：
降低循环数。

3）四种dNTP的浓度不同
建议解决方法：
制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物