PCR和RT－PCR常见问题及解答
互联网
1940
| <font><strong><font>问 题</font> </strong> </font> | <font><strong><font>可能原因</font> </strong> </font> | <font><strong><font>建议解决方法</font> </strong> </font> |
| <font>RT-<u>PCR</u> 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-<u>PCR</u> 产物</font> | <font><u>RNA</u> 被降解</font> | <font>在用来验证完整性之前先在变性胶上分析<u>RNA</u><br /> 使用良好的无污染技术分离<u>RNA</u><br /> 在将组织从动物体取出后立刻处理<br /> 在100％甲酰胺中储存<u>RNA</u> 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。</font> |
| <font><u>RNA</u> 中包含逆转录抑制剂</font> | <font>通过乙醇沉淀<u>RNA</u> 除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对<u>RNA</u> 沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品<u>RNA</u> 的恢复。<br /> 逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。<br /> 将对照<u>RNA</u> 同样品混合，同对照<u>RNA</u> 反应比较产量以检验抑制剂。</font> | |
| <font>多糖同<u>RNA</u> 共沉淀</font> | <font>使用氯化锂沉淀<u>RNA</u> 以除去多糖。</font> | |
| <font>用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火</font> | <font>确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。<br /> 对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。</font> | |
| <font>起始<u>RNA</u> 量不够</font> | <font>增加<u>RNA</u> 量。<br /> 对于＜50ng的<u>RNA</u> 样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。</font> | |
| <font><u>RNA</u> 模板二级结构太多</font> | <font>将<u>RNA</u> 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火<br /> 提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。<br /> 注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。<br /> 对于＞1kb的RT-<u>PCR</u> 产物，保持反应温度≤65℃。<br /> 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。<br /> 如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。</font> | |
| <font>引物或模板对残余的<u>RNA</u> 模板敏感</font> | <font>在<u>PCR</u> 前用RNaseH处理。</font> | |
| <font>靶序列在分析的组织中不表达</font> | <font>尝试其他靶序列或组织</font> | |
| <font><u>PCR</u> 没有起作用</font> | <font>对两步法RT-<u>PCR</u> ，不要在<u>PCR</u> 步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物</font> | |
| <font><u>PCR</u> 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-<u>PCR</u> 产物</font> | <font><u>PCR</u> 引物设计较差</font> | <font>避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。</font> |
| <font>DNA含有抑制剂</font> | <font>诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA</font> | |
| <font>富含GC的模板</font> | <font>对于GC含量＞50％的模板，使用<u>PCR</u> x Enhancer Solution。</font> | |
| <font>模板浓度太低</font> | <font>使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。</font> | |
| <font>镁离子浓度太低</font> | <font>从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量<u>PCR</u> ，使用3mM到5mM的镁离子浓度。</font> | |
| <font>退火温度太高</font> | <font>使用<strong>表4</strong> 的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。</font> | |
| <font><u>PCR</u> 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-<u>PCR</u> 产物</font> | <font>引物浓度太低</font> | <font>最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见<strong>公式1，2</strong> ）</font> |
| <font>RT-<u>PCR</u> 特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带</font> | <font>引物和模板非特异性退火</font> | <font>在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。</font> |
| <font>GSP设计较差</font> | <font>遵循用于扩增引物设计的同样原则</font> | |
| <font><u>RNA</u> 中沾染了基因组 DNA</font> | <font>使用扩增级DNaseⅠ处理<u>RNA</u> 。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。</font> | |
| <font>形成引物二聚体</font> | <font>设计在3'端没有互补序列的引物。</font> | |
| <font>引物和模板非特异性退火</font> | <font>以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。<br /> 在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。<br /> 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动<u>PCR</u> 。<br /> 避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。</font> | |
| <font>镁离子浓度太高</font> | <font>对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。</font> | |
| <font>因为扩增复杂模板导致引物错误起始</font> | <font>使用巢式<u>PCR</u> 或递减<u>PCR</u> 。</font> | |
| <font>沾染外源DNA</font> | <font>使用抗气雾剂的吸头和UDG（见<strong>第八章</strong> ）。</font> | |
| <font>因为二级结构导致引物结合位点无法接近</font> | <font>对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）<u>PCR</u> x Enhancer Solution。</font> | |
| <font><u>PCR</u> 忠实性：<u>PCR</u> 在产物序列中引入了错误</font> | <font>聚合酶忠实性低</font> | <font>使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。</font> |
| <font>循环数太多</font> | <font>降低循环数。</font> | |
| <font>四种dNTP的浓度不同</font> | <font>制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。</font> | |
| <font>定量RT-<u>PCR</u><br /> 无扩增产量<br /> 相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照</font> | <font>无cDNA合成</font> | <font> </font> |
| <font>cDNA合成温度太高</font> | <font>降低保温温度</font> | |
| <font>反转录cDNA产物被二级结构封闭</font> | <font>提高保温温度。重新设计引物</font> | |
| <font><u>RNA</u> 被损害或降解</font> | <font>必要的话更换<u>RNA</u> </font> | |
| <font><u>RNA</u> se污染</font> | <font>维持无菌条件；加入RNase抑制剂</font> | |
| <font>荧光探针无功能</font> | <font>确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。<br /> 用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。<br /> 必要的话设计和合成探针。</font> | |
| <font>灵敏度低<br /> 须在比预期更高的循环中检出产物</font> | <font>初始模板<u>RNA</u> 不充分</font> | <font>增加模板<u>RNA</u> 的浓度；使用10ng-1µg的总<u>RNA</u> </font> |
| <font><u>RNA</u> 被损害和降解</font> | <font>必要的话更换<u>RNA</u> </font> | |
| <font><u>RNA</u> se污染</font> | <font>维持无菌条件；加入RNase抑制剂</font> | |
| <font>无效的cDNA</font> | <font>通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备<u>RNA</u> 过程中的抑制剂</font> | |
| <font>无效的<u>PCR</u> 扩增</font> | <font>注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺<br /> 调整cDNA合成温度或引物设计</font> | |
| <font>信号高于预期<br /> 在低于预期的循环中即可检出产物</font> | <font>反应中加的样品太多</font> | <font>降低模板的浓度</font> |
| <font>模板或<u>PCR</u> 残余污染</font> | <font>隔离污染来源，更换试剂<br /> 使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。</font> | |
| <font>电泳后出现意外的条带</font> | <font><u>RNA</u> 被基因组 DNA污染</font> | <font>用DNase I预处理<u>RNA</u> </font> |
| <font>用于第一链合成的寡聚dT或随机引物</font> | <font>使用基因特异性引物</font> | |
| <font><u>PCR</u> 的低特异性</font> | <font>优化<u>PCR</u> 条件</font> |
<center>
<p>
</p>
</center>
<font>上一篇：聚合酶链式反应（PCR）实验方法 下一篇：Single Primer ("Semi-Random") P<br /> </font>
<font>上一篇：聚合酶链式反应（PCR）实验方法 下一篇：Single Primer ("Semi-Random") P<br /> </font>
