PCR和RT-PCR常见问题及解答
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问 题 | 可能原因 | 建议解决方法 |
RT-PCR 灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR 产物 | RNA 被降解 |
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA 使用良好的无污染技术分离RNA 在将组织从动物体取出后立刻处理 在100%甲酰胺中储存RNA 如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。 |
RNA 中包含逆转录抑制剂 |
通过乙醇沉淀RNA 除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA 的恢复。 逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,亚精胺,甲酰胺和胍盐。 将对照RNA 同样品混合,同对照RNA 反应比较产量以检验抑制剂。 |
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多糖同RNA 共沉淀 | 使用氯化锂沉淀RNA 以除去多糖。 | |
用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火 |
确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。 对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。 |
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起始RNA 量不够 |
增加RNA 量。 对于<50ng的RNA 样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。 |
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RNA 模板二级结构太多 |
将RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火 提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。 注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。 对于>1kb的RT-PCR 产物,保持反应温度≤65℃。 注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。 如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。 |
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引物或模板对残余的RNA 模板敏感 | 在PCR 前用RNaseH处理。 | |
靶序列在分析的组织中不表达 | 尝试其他靶序列或组织 | |
PCR 没有起作用 | 对两步法RT-PCR ,不要在PCR 步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物 | |
PCR 灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR 产物 | PCR 引物设计较差 | 避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。 |
DNA含有抑制剂 | 诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA | |
富含GC的模板 | 对于GC含量>50%的模板,使用PCR x Enhancer Solution。 | |
模板浓度太低 | 使用10^4拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。 | |
镁离子浓度太低 | 从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR ,使用3mM到5mM的镁离子浓度。 | |
退火温度太高 | 使用表4 的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。 | |
PCR 灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR 产物 | 引物浓度太低 | 最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。(见公式1,2 ) |
RT-PCR 特异性:在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带 | 引物和模板非特异性退火 | 在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。 |
GSP设计较差 | 遵循用于扩增引物设计的同样原则 | |
RNA 中沾染了基因组 DNA | 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA 。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。 | |
形成引物二聚体 | 设计在3'端没有互补序列的引物。 | |
引物和模板非特异性退火 |
以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。 在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR 。 避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。 |
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镁离子浓度太高 | 对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。 | |
因为扩增复杂模板导致引物错误起始 | 使用巢式PCR 或递减PCR 。 | |
沾染外源DNA | 使用抗气雾剂的吸头和UDG(见第八章 )。 | |
因为二级结构导致引物结合位点无法接近 | 对于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCR x Enhancer Solution。 | |
PCR 忠实性:PCR 在产物序列中引入了错误 | 聚合酶忠实性低 | 使用带有校正活性的热稳定聚合酶,如Platinum Pfx DNA聚合酶。 |
循环数太多 | 降低循环数。 | |
四种dNTP的浓度不同 | 制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。 | |
定量RT-PCR 无扩增产量 相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照 |
无cDNA合成 | |
cDNA合成温度太高 | 降低保温温度 | |
反转录cDNA产物被二级结构封闭 | 提高保温温度。重新设计引物 | |
RNA 被损害或降解 | 必要的话更换RNA | |
RNA se污染 | 维持无菌条件;加入RNase抑制剂 | |
荧光探针无功能 |
确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。 用DNase处理TaqMan探针,校验荧光是否增强。 必要的话设计和合成探针。 |
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灵敏度低 须在比预期更高的循环中检出产物 |
初始模板RNA 不充分 | 增加模板RNA 的浓度;使用10ng-1µg的总RNA |
RNA 被损害和降解 | 必要的话更换RNA | |
RNA se污染 | 维持无菌条件;加入RNase抑制剂 | |
无效的cDNA | 通过增加70%乙醇清洗的次数来去除制备RNA 过程中的抑制剂 | |
无效的PCR 扩增 |
注意:反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺 调整cDNA合成温度或引物设计 |
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信号高于预期 在低于预期的循环中即可检出产物 |
反应中加的样品太多 | 降低模板的浓度 |
模板或PCR 残余污染 |
隔离污染来源,更换试剂 使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应,使用抗气溶胶的吸头。 |
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电泳后出现意外的条带 | RNA 被基因组 DNA污染 | 用DNase I预处理RNA |
用于第一链合成的寡聚dT或随机引物 | 使用基因特异性引物 | |
PCR 的低特异性 | 优化PCR 条件 |
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