荧光标记法（差示反转录PCR实验）

1. 标本

人单核细胞系U937，细胞密度2×10⁸/L，分对照组（N）、处理Ⅰ组（T1）、处理Ⅱ组（T 2），N用1640培养基及10%胎牛血清培养，T1用IFN-γ104U/L LPS 1 μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0 μg/L分别刺激7 h。

1. 按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA，以 RNase-free DNase I（终浓度80 000 U/L）除去其中污染的 DNA经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检测其纯度。

1. 逆转录反应

选择锚定引物[T7（dT12）AP(anchored prime rs，AP)]，序列为5'ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3'，其中 M=A/G/C。N=A /G/C/T]，以总RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA l.0μg，AP 4 pmol ，70℃ 5 min，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH8.3），75 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，10mmol /L DTT，25μmol/L，dNTPmix（1∶1∶1∶1），SuperScriptⅡ 60 Units，总反应体系20 μl ，42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。

2. 荧光标记差异显示PCR

选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物[TMR-T7(dT12)AP]，随机引物（5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3'），以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，3.75 mmol/L MgCl₂，逆转录产物3.0 μl，50 μmol/L dNTP mix（1∶1∶1），0.35 μmol/L 5'-随机引物，0.35 μmol/L 3-锚定引物，Ampli Taq 0.5 Units，总反应体系10 μl。反应步骤如下：95℃ 2 min；94℃ 15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4个循环； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环；72℃延伸7 min。

3. 分离差异显示片段

配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.25 mm，大小61×33 cm。将PCR产物加4.0 μl上样缓冲液，95℃变性后上样。3 000 V、100 W 、55℃电泳4.5 h。干胶后置于Genomyx SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分 析处理扫描结果。

4. 回收差异条带

用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手术刀片切割下所需条带，置于30 μl去离子水中，37℃水浴30-60 min，备用。

5. 差异条带的再扩增

以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子22-mer（5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3’）、反M13（-48）24-mer（5'AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3'）为引物，进行再扩增反应：模板2.0 μl，20 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl₂，20 μmol/L dNTP mix（1∶1∶1∶1），0.2 μmol/L T7、0 .2 μmol/L M13-r、AmpliTaq 1.0 U nits，总反应体系20 μl。反应条件同差异显示PCR。

一、实验讨论

基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间 的未知表达基因的差异，是研究生命本质的有效途径。1992年报道的真核细胞mRNA差异显示技术，为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、 可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的强弱等优点，一经问世即受到许多领域的重视并得以广泛应用。然而，该技术也存在着一些缺陷，主要表现为：cDNA产物的质量较低，在序列胶中往往呈不清晰状态；所得的cDNA片段通常小于500 nt，往往是3'-端的非翻译（编码）序列；所得差异片段的假阳性高，可高达85%等。

荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极大减少了上述不足。

差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将总mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物 产生的第一条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD专用的随机引物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3'-端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。通过改变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达1.0-1.5 kb， 因较长的cDNA片段容易通过Northern blot 进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且其中可提供更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。

文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致。通常， 再扩增的引物与DD引物相同，本试验将再扩增引物设计为T7（22-mer）与M13-r（24-mer），此为在锚定引物的5' 端和随机引物的3' 端分别增加的序列（本文方法中所列差异显示引物序列的 划线部分），这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的机会。同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成cRNA探针，为cDNA片段的直接测序和鉴定（RPA或Northern分析）提供了方便。

用常规的序列分析胶进行分辨时，较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本 操作改用5.6%的PAGE胶（聚丙烯酰胺），减少胶的厚度（仅250μm），通过提高电泳的电压（3000 V）及温度（55℃），可显着提高分辨率。

同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，基本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物 质标记于锚定引物的5’端，可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期仅两天。