荧光标记怎么选择？

荧光蛋白和荧光素酶是在基因工程中广泛使用的两类报告基因 (reporter gene)，是研究生物分子或细胞活动规律及本质的重要工具。

荧光蛋白

荧光蛋白能被一定波长的光激发，电子被激发到高能级，随后向低能级跃迁的过程中发出比激发光波长更长的荧光。绿色荧光蛋白（GFP）最初是在水母中发现的，随后各种颜色的荧光蛋白被开发出来。目前荧光蛋白按照颜色分类主要分为绿色系、红色系、蓝色系、青色系、黄色系和橙色系（表 1）。这么多的荧光蛋白，可以根据哪些方面来选择呢？

激发峰/发射峰：每种荧光蛋白都有其独特的激发波长和发射波长，需匹配荧光成像系统的检测范围。同时检测多种荧光蛋白时，需避免颜色和光波长的冲突。绿色和红色荧光蛋白较为常用。红色或近红外的荧光蛋白更适用于活体成像。

单体性质：荧光蛋白多聚体可能会影响融合蛋白的生物学功能和定位，应尽量选择单体。

亮度：荧光蛋白的亮度值由消光系数与量子产率的乘积计算得出。在许多情况下，将荧光蛋白的亮度与 EGFP（设定为 1）进行比较（表 1），应选择足够亮的荧光蛋白便于检测和成像。

PK 值：每个荧光蛋白都有其最适 pH 值，此时的荧光强度最高。在细胞内，大多数细胞器内及细胞质的pH值都在 7.0 左右，然而溶酶体内的 pH 值就比较低，mCherry 的 PK 值比较低，可以用于标记溶酶体内的蛋白。

光稳定性：荧光蛋白被不断激发的过程中，会逐渐失去发光能力。对于高质量成像、荧光信号定量分析以及详细描述生物模型，需要选择光稳定性好的荧光蛋白。在普通荧光成像中，例如激光共聚焦对光稳定性要求不是很高，而超分辨荧光成像对光稳定性要求比较高。

成熟时间：指荧光蛋白翻译后正确折叠并形成发光结构所需的时间。成熟时间较长的荧光蛋白不适合标记短寿命的蛋白，目的蛋白在荧光蛋白成熟前被降解，导致无法追踪及定位目的蛋白。因此，选择荧光蛋白时也需要考虑其成熟时间。

氧气：许多荧光蛋白的成熟需要氧气，特别是衍生自 GFP 的那些荧光蛋白。如果这些荧光蛋白处于缺氧环境，那可能就观察不到荧光。

温度：温度也会影响荧光蛋白的成熟时间和荧光强度，例如 EGFP 适合在 37℃ 下使用。

融合位置：荧光蛋白的融合位置（N 端或C 端）主要取决于目的蛋白折叠过程中，荧光蛋白所在的那一端有没有参与蛋白质的折叠。如果标记的目的蛋白是一个新的蛋白，可分别进行 N 端和 C 端融合表达，以此来进行选择最后的融合位置。

表 1. 常用荧光蛋白特性

荧光素酶

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够催化荧光素产生生物发光的酶的统称，其中主要有萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，FLuc）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，RLuc）。荧光素酶报告系统非常灵敏，可以高效地检测基因的表达和细胞的活动情况，是分析转录因子与启动子活性、miRNA 与靶基因相互作用以及活体成像等的有效方法。

萤火虫荧光素酶（FLuc）：FLuc 的底物是荧光素，催化反应需同时有 ATP、Mg²⁺、O₂ 的参与，发光波长为560nm，发光颜色呈黄绿色（图 1）。FLuc 通常作为报告基因，反映目的基因的表达情况。其转录翻译后无需修饰，即可具有酶活性。

图 1. FLuc 与荧光素的反应式

海肾荧光素酶（RLuc）：RLuc 催化腔肠素发光需要 O₂ 的参与，发光波长为 465nm，发光颜色为蓝色（图 2）。在双荧光素酶报告系统中，RLuc 通常作为内参报告基因。RLuc 也无需翻译后修饰，即可形成酶活性。

图 2. RLuc 与腔肠素的反应式

荧光蛋白和荧光素酶的区别

荧光蛋白发光过程属于物理反应，荧光素酶催化底物发光属于化学反应。还有除了来源不同之外，它们主要在发光原理、检测方法和用途方面均有不同。

发光原理：荧光蛋白发光无需任何底物或辅助因子；而荧光素酶本身不发光，是通过与底物进行化学反应后释放出光子。

检测方法：荧光蛋白很容易通过共聚焦显微镜、荧光显微镜或流式细胞仪分析而在活细胞中被检测到。荧光素酶的活性定量检测通常使用酶标仪，荧光强度与荧光素酶活性成正比。另外，荧光蛋白的荧光信号远远强于荧光素酶系统，但其背景信号也较高，研究活体成像时灵敏度不如荧光素酶系统。

用途：荧光蛋白通常用于定位或定性分析；而荧光素酶能够定量地分析表达水平。需要注意的是，利用荧光素酶系统观察活体成像时是属于定性检测。

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