原理
免疫荧光标记技术(immunofluorescence technique)是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素,当与其相对应的抗原或抗体起反应时,在形成的复合物上就带有一定量的荧光素,在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位,检测出抗原或抗体。
材料与仪器
组织样品
PBS 抗体
玻片 加湿盒
PBS 抗体
玻片 加湿盒
步骤
1. 将湿纸巾铺于载玻片盒底部做成加湿盒,由冰冻切片仪中取出载有切片的载玻片,放入玻片盒中(每边放6片),或故湿盒中(载玻片勿相互接触)。
2. 待载玻片达室湿且未干时,铺加PBS于切片上(勿溢出玻片)。
3. 稀释的第一杭体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min(每一载玻片上加40~50 ul 抗体,应能盖住切片)。
4. 用与泵相连的巴斯德吸管,在切片的一端吸去玻片上的PBS,并从另一端加上抗体,盖上加湿盒,室温温育1 h。
5. 以PBS冼玻片3次(5 min/次),从切片一端加入新的PBS缓冲液,由另一端吸去旧的缓冲液。
6. 稀释的第二抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min(每载玻片可加40~50 ul 抗体)。
7. 将第二抗体加于切片上,置加湿盒中室温温育1 h,以PBS洗玻片3次(5 min/次)。
图一、免疫组化标记的各种方法
8. 将盖玻片放于纸巾上,滴加1滴Gelvatol 于盖玻片中央。翻过载玻片放于盖玻片上(勿施压),将玻片置工作台上,用铝箔覆盖避光放置30 min,使Gelvatol 凝结。
9. 显微镜下观察结果,或置玻片盒中贮于4℃。
注意事项
1、荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4℃保存4h,时间过长,可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照:
(1) 阳性对照:阳性血清+荧光标记物;
(2) 阴性对照:阴性血清+荧光标记物;
(3) 荧光标记物对照:PBS+荧光标记物。
常见问题
免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化,不同点如下:
1、免疫荧光不需要使用双氧水处理,封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育,孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油:0.01M PBS (1:1)。条件许可,建议购买抗淬灭的封片液,使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多,需要分别设定阳性和阴性对照。
来源:丁香实验